Método para determinar la eficacia antitumoral de anticuerpos monoclonales.

Método para la determinación de la eficacia antitumoral de un anticuerpo monoclonal,

que comprende las etapas consecutivas de:

a) aplicación de células tumorales en un roedor, en la que el roedor es un ratón o una rata, b) medición del tamaño tumoral de dicho roedor en dependencia del tiempo hasta que el tamaño tumoral excede 100 mm3, c) aplicación de hibridomas productores de dicho anticuerpo monoclonal en dicho roedor, y d) medición del tamaño tumoral en dicho roedor portador tumoral en dependencia del tiempo

en el que el método se utiliza para priorizar anticuerpos terapéuticos con eficacia antitumoral tras la inmunización.

DESCRIPCiÓN

Mélodo para determinar la eficacia antilumoral de anticuerpos monoclonales La presente invención se refiere a un método para determinar la eficacia antitumoral de anticuerpos monoclonales en ensayos preclínicos con roedores y a la utilización de dicho método para la reducción de ensayos complementarios Antecedentes de la invención Los anticuerpos monoclonales para el tratamiento terapéutico del caneer se someten a un procedimiento de evaluación largo y costoso. Habitualmente se derivan mediante, por ejemplo, inmunización con el antígeno tumoral respectivo o fragmentos del mismo, lo que rinde hibridomas productores del anticuerpo monoclonal contra el antigeno tumoral. Antes de una evaluación intensiva posterior, debe llevarse a cabo un largo procedimiento de purificación, después del cual se evalúan en primer lugar in vitro y después en estudios animales predinicos. En los estudios in vitro se determina principalmente su afinidad de unión al antígeno tumoral respectivo y la inhibición del crecimiento sobre células tumorales humanas, lo que es un requisito previo para los ensayos animales predínicos. Sin embargo, se ha demostrado que la inhibición in vitro del crecimiento de células tumorales no siempre se correlaciona con la eficacia en los estudios animales in vivo de xenoinjertos. Se ha demostrado que los anticuerpos que presentan una buena actividad antiproliferativa in vivo pueden ser totalmente inactivos en el modelo preclínico in vivo, mientras que algunos anticuerpos inactivos in vitro pueden presentar una eficacia significativa in vivo. Por lo tanto, en general la experimentación animal predínica para dichos anticuerpos es amplia y prolongada, y deben someterse a ensayo un gran número de anticuerpos diferentes por el pobre potencial predictivo de los estudios in vitro. Por lo tanto, una reducción de la experimentación animal preclínica ademas de menos procedimientos laboriosos es una tarea importante en el desarrollo de anticuerpos monoclonales contra las enfermedades tumorales.

Staquet y Giles-Komar (Hybridoma 25:68-74, 2006) describen un método para la evaluación in vivo de los anticuerpos monoclonales. Inyectaron hibridomas en Matrigel por via subcutánea en ratones. Cuatro dias después se inyectaron por vía subcutánea células tumorales en los mismos ratones y se midió durante el tiempo el crecimiento tumoral. Un crecimiento tumoral reducido o la falta de crecimiento tumoral en comparación con los hibridomas de control indicaba la eficacia antiproliferativa de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas respectivos. Con este método resulta posible distinguir los anticuerpos con actividad antitumoral de los anticuerpos sin actividad antitumoral. Sin embargo, dicho método proporciona posibilidades de diferenciación pobres o nulas para diferenciar entre el potencial antiproliferativo de los anticuerpos, los cuales todavia necesitan purificarse a partir de los hibridomas y someterse a ensayo nuevamente para evaluación adicional de su potencial antiproliferativo Descripción resumida de la invención Un aspecto de la invención es un método para la determinación de la eficacia antitumoral de un anticuerpo monoclonal que comprende las etapas consecutivas de:

a) aplicación de células tumorales a un roedor, en el que el roedor es un ratón o una rata,

b) medición del tamaño tumoral de dicho roedor en dependencia del tiempo hasta que el tamaño tumoral excede 3

(} mm,

c) aplicación de hibridomas productores de dicho anticuerpo monoclonal en dicho roedor, y

d) medición del tamaño tumoral de dicho roedor portador tumoral en dependencia delliempo El método según la invención es un procedimiento más rápido y eficiente para identificar, diferenciar y priorizar nuevos anticuerpos terapéuticos con eficacia antitumoral tras la inmunización en comparación con los ensayos convencionales y la priorización tras la purificación y preselección in vitro Otro aspecto de la invención es la utilización de dicho método para la reducción de la experimentación preclinica Descripción detallada de la invención Una realización de la invención es un método para la determinación de la eficacia antitumoral de un anticuerpo monoclonal que comprende las etapas consecutivas de:

al aplicación de células tumorales a un roedor, en el que el roedor es un ratón o una rata,

b) medición del tamaño tumoral de dicho roedor en dependencia del tiempo hasta que el tamaño tumoral excede 10 (} mm3,

c) aplicación de hibridomas productores de dicho anticuerpo monoclonal en dicho roedor, y

d) medición del tamaño tumoral de dicho roedor portador tumoral en dependencia delliempo

En la etapa a) , la aplicación preferentemente es una inyección subcutánea, ortotópica o intravenosa, más preferentemente una inyección subcutánea; las células tumorales son humanas; el roedor preferentemente es un ratón o rata, más preferentemente un ratón,

3

En la etapa b) , se mide el tamaño tumoral hasta que el tamaño tumoral es de entre 100 mm 3 y 300 mm

En la etapa c) , la aplicación preferentemente es una inyección subcutánea de los hibridomas en Matrigel o en fibras huecas, más preferentemente en MatrigeL

Opcionalmente, se añade una etapa adicional e) en la que se sacrifica el roedor y se investiga adicionalmente para efectos secundarios,

Dicho anticuerpo monoclonal producido por dichos hibridomas es un anticuerpo de unión a un antigeno tumoral que se expresa sobre la superficie celular de dichas células tumorales, que se utilizan en el método según la invención,

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos. Dichas moléculas son producidas por "hibridomas" tras la inmunización con los antígenos tumorales respectivos. El antígeno puede introducirse para la inmunización en, por ejemplo, un ratón o rata u otro animales mediante cualesquiera medios adecuados Preferentemente, el animal se inmuniza por via intraesplénica, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutánea, por sí solo o en combinación con agentes inmunomoduladores apropiados (por ejemplo CFA) . La dosis de cada antígeno preferentemente debe encontrarse comprend ida en el intervalo de entre 1 y 500 mg. Los linfocitos de ratón resultantes pueden aislarse y fusionarse con una célula humana o de heteromieloma utilizando PEG o electrofusión basada en protocolos estándares para generar hibridomas. La electrofusión se basa en un cambio estructural reversible de las membranas celulares que está causado por los efectos de un campo eléctrico y es aplicable a un amplio espectro de células para la fusión de dos o más células del mismo origen o de orígenes diferentes, incluyendo sus estructuras completas (núcleo, membranas, orgánulos y citoplasma) para crear una nueva célula viable. Lo anterior resulta en hibridomas productores de anticuerpos monoclonales, los cuales resultan adecuados para el método según la invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión 'unión" o 'unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno tumoral en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo ELlSA celular con células CHO que expresan antígeno de tipo salvaje. El término unión se refiere a una afinidad de unión (K o) de 10-6 M o inferior, preferentemente de entre 10.13 M Y 10.9 M. La unión del anticuerpo al antigeno puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) . La afinidad de la unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antigeno) , ko (constante de disociación) y Ko (kolka)

El método según la invención representa una mejora respecto a los ensayos convencionales de anticuerpos purificados, por varios motivos (ver también la Tabla 1) : mediante priorización previamente a la purificación de los anticuerpos sólo se purifican los anticuerpos más eficaces, los hibridomas más interesantes, para la caracterización posterior, lo que implica una reducción significativa del número de purificaciones de anticuerpos, acelera el desarrollo de nuevos anticuerpos terapéuticos y reduce los esfuerzos generales de experimentación necesarios para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos (en comparación con el ensayo de muchos anticuerpos purificados) Además, los anticuerpos de hibridomas de baja producción, que con frecuencia se omiten en la evaluación posterior (la omisión se debe a su baja tasa de producción en los hibridomas, lo que dificulta obtener cantidades suficientes... [Seguir leyendo]

Método para la determinación de la eficacia antitumoral de un anticuerpo monoclonal, que comprende las etapas consecutivas de:

a) aplicación de células tumorales en un roedor, en la que el roedor es un ratón o una rata, b) medición del tamaño tumoral de dicho roedor en dependencia del tiempo hasta que el tamaño tumoral excede 100 mm3, e) aplicación de hibridomas productores de dicho anticuerpo monoclonal en dicho roedor, y d) medición del tamaño tumoral en dicho roedor portador tumoral en dependencia del tiempo

en el que el método se utiliza para priorizar anticuerpos terapéuticos con eficacia antitumoral tras la inmunización 2. Método para la reducción de la experimentación preclinica en animales roedores, caracterizado por:

a) la utilización para la evaluación de la eficacia antitumoral de anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas, del método según la reivindicación 1, Y b) la priorización de uno a tres anticuerpos monoclonales, preferentemente un anticuerpo monoclonal, para la evaluación preclinica adicional