Método de obtención de una estructura de polímero de impronta molecular (MIP).

La presente invención se refiere a un nuevo método para la realización de patrones de MIP a escala micrométrica y sub-micrométrica por escritura directa por haz de electrones.

La mezcla precursora de MIP contiene compuestos sensibles a la irradiación electrónica y se deposita en forma de película sobre un substrato. Las zonas de la película irradiadas con un haz de electrones son eliminadas con un disolvente químico o revelador. La película resultante contiene los patrones deseados y se polimeriza utilizando luz y/o calor. El método de síntesis de patrones de MIPs de la invención permite la realización de matrices de numerosos sensores basados en MIPs sobre un substrato o chip de pequeñas dimensiones para la detección simultanea de múltiples compuestos (bio)químicos, además de otras diversas aplicaciones.

MÉTODO DE OBTENCiÓN DE UNA ESTRUCTURA DE POLiMERO DE IMPRONTA

MOLECULAR (MIP)

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la fabricación o sintesis de estructuras para detección molecular. En concreto, en la producción de micro sensores quimicos basados en patrones de polimeros de impronta molecular (MIPs) sobre substratos, en la fabricación de chips para detección de analitos con aplicación en quimica analítica y medicina.

Antecedentes de la invención La tendencia de la técnica en el desarrollo de dispositivos sensores quimicos es su miniaturización a escala micrométrica o sub-micrométrica. La utilización de componentes minitaurizados presenta numerosas ventajas, entre otras que el volumen de analito puede ser reducido, el consumo de energia para su funcionamiento también es menor, se reducen los costes de producción y diversifican las aplicaciones.

La técnica ha desarrollado transductores ópticos, eléctricos y mecánicos basados en los materiales tradicionales de la industria microelectrónica, que son los semiconductores y dieléctricos inorgánicos, metales y resinas poliméricas. Sin embargo, dotar a estos transductores de una función sensora tal como el reconocimiento molecular para identificar analitos de origen quimico o biológico requiere la incorporación de materiales sensores o funcionales "blandos". Los materiales blandos son materiales orgánicos amorfos de alta viscosidad que normalmente no son compatibles con las técnicas de fabricación utilizadas en la industria de semiconductores.

Los biosensores integran biomoléculas como elementos de reconocimiento tales como enzimas, anticuerpos o ADN, con frecuencia inestables cuando se sacan de su ambiente natural. Suelen requerir conservación a bajas temperaturas y pueden no resistir ciertas condiciones de operación y almacenamiento, lo cual limita su utilidad especialmente en sistemas portátiles.

Una estrategia alternativa es la integración en el sensor de receptores sintéticos biomiméticos, tales como los polímeros de impronta molecular o MIPs ("Molecularly Imprinted Polymers") (K. Haupt, "Creating a good impression", Nat. Biotech. 2002, 20,

884) . 5

Los MIPs son materiales sintéticos que se utilizan como elementos de reconocimiento molecular. La patente EP 1237936 B1 describe un procedimiento general para la obtención de MIPs basado en la formación de una estructura macromolecular entrecruzada alrededor de una molécula que actúa como plantilla molecular o molde y

que se extrae tras la polimerización. Cuando los MIPs son estructurados a escala submicrométrica aumenta su sensibilidad en el reconocimiento de moléculas debido a que presentan una mayor superficie de detección.

Entre las ventajas que aporta el empleo de MIPs frente a los biomoléculas, por

ejemplo anticuerpos, ácidos nucleicos, enzimas, etc., constan su capacidad de trabajar en condiciones extremas de pH, temperatura y en presencia de disolventes orgánicos, sin perder por ello su estructura o afinidad por el analito.

La mayoría de MIPs se preparan en la técnica a partir de mezclas precursoras de monómeros. Las mezclas precursoras que utilizan oligómeros o polimeros se desarrollan para usos y analitos muy especificos. Li describe la preparación de una mezcla precursora de MIPs para teofilina que comprende polímeros de composición muy parecida a las de la presente invención, también con presencia de dobles enlaces en cadenas laterales de dichos pOlímeros (Li et al. "$ynthesis and Characterization of

Functional Methacr y late Copolymers and their Application in Molecular Imprinting", Macromolecules 2005, 38, 2620-2625) . La publicación especula con la posibilidad de utilizar estos MIPs como biosensores, aunque no dice ni sugiere ningún procedimiento para realizarlo, y por tanto el experto en la técnica no encontraría obvio llegar a la presente invención a partir de las enseñanzas de esta publicación.

El desarrollo de biochips basados en MIPs se realiza por estampación sobre un substrato, normalmente una oblea. En la técnica actual esto se ha conseguido realizar a escala micrométrica utilizando distintos métodos, que se pueden clasificar en técnicas de ~contacto" y "sin contacto".

Entre las técnicas de contacto se encuentran el depósito con una micropunta (F. Vandevelde y col. "Oirect patterning of molecularly imprinted microdot arrays for sensors and biochips", Langmuir 2007, 23, 6490) , la litografía "blanda" (M. Yan y col. "Fabricatíon of molecularly imprinted polymer mícrostructures", Anal. Chím. Acta 2001 , 5 435, 163) y, recientemente, la fotolitografía de contacto por radiación UV (A = 365 nm)

(S. Guillón y col. "Single step patterning 01 molecularly imprinted polymers lor large scale fabrícation of mícrobiochips", Lab Chip 2009, 9, 2987) . Los métodos de contacto presentan el ínconveniente de la íncompatíbílídad química de las superficíes que interaccionan. Por ejemplo, en litografía blanda un sello de polídimetíl siloxano (PDMS) 10 se pone en contacto con la solución precursora del MIP para formar el patrón definido por el sello; sin embargo el POMS es incompatíble con los dísolventes más habítuales empleados en la síntesís de MIPs, y degrada la calidad del material. La reciente demostración realizada por Guillón del uso de fotolitografía para estampar MIPs a escala de oblea con resolución micrométrica es un avance significativo hacia la fabricación en paralelo de biochips basados en MIPs; no obstante, estos autores utilizaron el método fotolitográfico de contacto, es decir, que la máscara contacta la película de material políméríco con el consecuente problema de la calídad final del material.

Los métodos sin contacto evitan este inconveniente. Sin embargo, el número de estrategias de polimerización sin contacto aplicadas a MIP y probadas en la técnica se reduce a dos.

La primera requiere el empleo de un haz de radiación electromagnética focal izado para polimerizar el material por un mecanismo fotoquímico o térmico. Se han reportado dos realizaciones de esta aproximación: La micro-estereo-litografía por haz láser de A=364 nm conseguió realizar estructuras MIP del orden de decenas de micras (P.G. Conrad 11, y col. "Functional molecularly imprinted polymer microstructures labricated using microstereolithography", Advanced Materials 2003, 15, 1541) ; La segunda realización emplea un haz láser de CO2 de 750 mW que permite incrementar la temperatura local hasta 70°C empleando 35 pulsos consecutivos de 5 ms, para obtener microarrays de puntos de 300 Jlm de diámetro (O.Y.F. Henr y , y col. "Fabrication of molecularly imprinted polymer microarray on a chip by mid-infrared laser pulse initiated polymerisation", Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23, 1769) .

La segunda estrategia emplea foto-máscaras para la polimerización de las zonas de interés. Esta aproximación se ha aplicado para la fabricación arrays de Il-puntos de MIP selectivos a f1uoresceína de 70-90 11m de diámetro (A.V. Linares y Col. "Patterning Nanostructured, Synthetic, Polymeric Receptors by Simultaneous Projection Photolithography, Nanomolding, and Molecular Imprinting" Small, 2011, 7, 2318) . La máscara se proyecta a través de un objetivo 10x sobre la solución precursora del MIP depositada sobre un portaobjetos de microscopio para su polimerización con una lámpara de mercurio. Alternativamente, empleando moldes de alúmina nanoporosa funcionalizados con fluoresceína o mioglobina, se han preparado puntos de aprox. 90 11m de diámetro formados por nanofilamentos improntados superficialmente con la molécula plantilla de interés, dispuestos paralelamente con un diámetro individual de 150 nm y 4 11m de longitud.

En una aproximación parecida, Byrne ha preparado geles improntados microestructurado, improntados con D-glucosa, con un espesor de 13 11m y distintas configuraciones geométricas (Byrne y col. "Microfabrication of intelligent biomimetic networks lor recognition 01 O-glucose" Chern. Mater. 2006, 18, 5869) .

Tanto las técnicas de contacto como sin contacto de biochips basados en MIPs presentan resoluciones espaciales superiores a la micra. Sin embargo las estructuras sensoras necesitan reducirse por debajo de la micra para incrementar significativamente su sensibilidad . Esto se ha logrado gracias a la posibilidad de crear fenómenos de confinamiento óptico, eléctrico o magnético en regiones submicrométricas, lo que consigue una mayor interacción entre el analito y la señal utilizada para su detección. Además, el empleo de estructuras sub-micrométricas permite reducir considerablemente tanto el volumen de muestra como la energía que precisa el sensor.

Las ventajas...

1. Método de obtención de una estructura de polímero de impronta molecular, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

(a) irradiación parcial con haz de electrones de una película formada por una mezcla precursora de polímeros de impronta molecular sobre un sustrato, en que dicha mezcla precursora comprende cadenas poliméricas ramificadas;

(b) eliminación por revelado con un disolvente químico de las moléculas afectadas por dicha irradiación con haz de electrones,

(e) polimerización de la película resultado de la etapa b) ; y

(d) extracción de dicho analito de la película polimerizada del paso e) por lavado químico.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende la etapa previa de preparar dicha película sobre el substrato por técnica de espineado.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 Ó 2, caracterizado por que dicho sustrato es una oblea de silicio.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicho sustrato es un vidrio.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha irradiación de la etapa a) se realiza con una máquina de litografía por haz de electrones.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la zona no irradiada de la película resultado de la etapa a) es inferior a 1 iJm en alguna de sus dimensiones.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicho ana lito es una molécula orgánica seleccionada entre el grupo formado por péptidos, antibióticos, pesticidas, micotoxinas, drogas, colorantes, biomoléculas y moléculas sintéticas de biomoléculas.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado por que dicha molécula orgánica es un colorante.

9. Método según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por que dicha molécula orgánica es una molécula fluorófora.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que

dicho disolvente químico de la etapa b) es tetrahidrofurano, metanol o

isopropanol, o sus mezclas.

11 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que

5 dicha polimerización de la etapa c) se realiza por calor y/o radiación

electromagnética.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado por que

dicho lavado químico del paso (d) se realiza en presencia de metan01 , etanol,

acetonitrilo, agua, acido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético o sulfato de

10 tetra-n-butilamonio, o sus mezclas.