Método de exploración, proceso para purificar oligómeros Abeta no difundibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligómeros Abeta no difundibles y un proceso para fabricar dichos anticuerpos.

Anticuerpo que comprende una cadena variable pesada (VH) y ligera (VL) en el que los dominios de CDR de cadena variable pesada y ligera comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes conjuntos de CDR:**Tabla**

Método de exploración, proceso para purificar oligómeros Aβ no difundibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligómeros Aβ no difundibles y un proceso para fabricar dichos anticuerpos La presente invención se relaciona con anticuerpos anti-globulómero Aβ, porciones de unión a antígeno de estos, hibridomas que producen dichos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, células huésped que comprenden dichos vectores, métodos para producir dichos anticuerpos, composiciones que comprenden dichos anticuerpos, usos de dichos anticuerpos en terapia y diagnóstico, y métodos correspondientes, relacionados con la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

En 1907, el médico Alois Alzheimer describió por primera vez las características neuropatológicas de una forma de demencia nombrada posteriormente en su honor (Alzheimer 1907) . La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa de demencia más frecuente entre las personas de edad, con una incidencia de aproximadamente 10 % entre la población con una edad superior a 65 años. Al aumentar la edad, también aumenta la probabilidad de contraer la enfermedad. En el mundo hay aproximadamente 15 millones de personas afectadas, y se espera que los incrementos adicionales en la expectativa de vida aumenten la cantidad de personas enfermas hasta aproximadamente el triple durante las siguientes décadas.

Desde un punto de vista molecular, la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por el depósito de proteínas agregadas de forma anormal. En el caso de las placas amiloides extracelulares, estos depósitos consisten principalmente en filamentos de péptidos β amiloides, en el caso de las redes neurofibrilares intracelulares (NFT) de la proteína tau. El péptido β amiloide (Aβ) surge de la proteína precursora β-amiloide merced a un corte proteolítico. Este corte es efectuado por la actividad cooperativa de varias proteasas, denominadas α, β y γ-secretasa. El corte resulta en una cantidad de fragmentos específicos con distintas longitudes. Las placas amiloides consisten principalmente en péptidos con una longitud de 40 o 42 aminoácidos (Aβ40, Aβ42) . El producto de corte dominante es Aβ40; sin embargo, Aβ42 tiene un efecto tóxico mucho más fuerte.

Los depósitos amiloides cerebrales y las alteraciones cognitivas muy similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer también son característicos del síndrome de Down (trisomía 21) , que ocurre con una frecuencia de aproximadamente 1 cada 800 nacimientos.

La hipótesis de la cascada amiloide de Hardy y Higgins postula que la producción incrementada de Aβ (1-42) resulta en la formación de protofibrillas y fibrillas, los componentes principales de las placas Aβ, donde estas fibrillas son responsables de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer. A pesar de la correlación baja entre la severidad de la demencia y la carga de placas Aβ depositadas, esta hipótesis fue favorecida hasta hace poco tiempo. El descubrimiento de formas solubles de Aβ en los cerebros con AD, que se correlacionan mejor con los síntomas de la AD que la carga de placas, ha resultado en una hipótesis revisada de la cascada amiloide.

La inmunización activa con péptidos Aβ ha resultado en una reducción de la formación, y también en la disolución parcial de las placas existentes. Al mismo tiempo, resulta en el alivio de los defectos cognitivos en modelos de ratones transgénicos APP.

También se verificó una reducción de la carga de placas Aβ para la inmunización pasiva con anticuerpos dirigidos a los péptidos Aβ.

Los resultados de una prueba de fase IIa (ELAN Corporation Plc, San Francisco Sur, CA, EEUU, y Dublín, Reino Unido) de inmunización activa con AN-1792 (péptido Aβ (1-42) en una condición de agregación fibrilar) sugieren que la inmunoterapia dirigida a los péptidos Aβ fue exitosa. En un subgrupo de 30 pacientes, el progreso de la enfermedad se vio reducido significativamente en pacientes con una titulación positiva de anticuerpos anti-Aβ, medida de acuerdo con los índices MMSE y DAD. Sin embargo, este estudio fue interrumpido debido a los efectos colaterales serios, en forma de una meningoencefalitis (Bennett y Holtzman, 2005, Neurology, 64, 10-12) .

La meningoencefalitis fue caracterizada por la neuroinflamación y la infiltración de células T en el cerebro. Presumiblemente, esto se debió a una respuesta inmune mediada por células T, inducida por la inyección de Aβ (142) como antígeno. Esta respuesta inmune no habría de esperarse después de una inmunización pasiva. Hasta la fecha, no hay datos clínicos disponibles con referencia a esto. Sin embargo, con referencia a este enfoque pasivo con respecto a la inmunización, se invocaron riesgos relacionados con el perfil de efectos colaterales, debido a estudios preclínicos en ratones APP23 muy viejos que recibieron un anticuerpo dirigido contra un epítopo N-terminal de Aβ (1-42) una vez por semana durante 5 meses. Estos ratones presentaron un incremento en la cantidad y la severidad de microhemorragias en comparación con los animales control tratados con solución salina (Pfeifer et al., 2002, Science, 298, 1379) . También se describió un incremento comparable en las microhemorragias en ratones Tg2576 y PDAPP muy viejos (de más de 24 meses) (Racke et al., 2005, J Neurosci, 25, 629-636; Wilcock et al. 2004, J. Neuroinflammation, 1 (1) :24; De Mattos et al., 2004, Neurobiol. Aging 25 (S2) :577) . En ambas cepas de ratones, la inyección de anticuerpos resultó en un incremento significativo de las microhemorragias. En contraste, un anticuerpo dirigido contra la región central del péptido Aβ (1-42) no indujo microhemorragias (de Mattos et al., supra) .

La ausencia de inducción de microhemorragias fue asociada con el tratamiento con anticuerpos que no se unieron al péptido Aβ agregado en forma de CAA (Racke et al., J Neurosci, 25, 629-636) . Sin embargo, el mecanismo exacto que resulta en las microhemorragias en ratones transgénicos para APP aún no ha sido comprendido. Presumiblemente, la angiopatía amiloide cerebral (CAA) induce o al menos agrava las hemorragias cerebrales. La CAA está presente en casi todos los cerebros con enfermedad de Alzheimer, y aproximadamente 20 % de los casos se consideran como “CAA severa”. Por consiguiente, la inmunización pasiva debería tener por objeto evitar las microhemorragias al seleccionar un anticuerpo que reconociera la región central o carboxiterminal del péptido Aβ.

En el documento WO2004/06756 se describen oligómeros Aβ (1-42) estables (globulómeros Aβ (1-42) ) y anticuerpos dirigidos específicamente contra los globulómeros. La digestión con proteasas no específicas demuestra que el globulómero Aβ puede digerirse comenzando con el extremo N hidrofílico que sobresale de la estructura globular principal (Barghom et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847) . Estos globulómeros Aβ con un corte N terminal (globulómeros Aβ (12-42) y Aβ (20-42) ) representan la unidad estructural básica de este oligómero Aβ. Son antígenos muy potentes para la inmunización activa de conejos y ratones que resulta en titulaciones de anticuerpos elevadas (documento WO2004/067561) . La función patológica potencial de las formas de Aβ con cortes N terminales in vivo ha sido sugerida en diversas publicaciones recientes donde se describió su existencia en cerebros con AD (Sergeant et al., 2003, J Neurochem, 85, 1581-1591; Thal et al., 1999, J Neuropathol. Exp Neurol, 58, 210-216) . Durante la digestión in vivo pueden participar determinadas proteasas halladas en el cerebro, por ejemplo, la neprilisina (NEP 24.11) o la enzima degradadora de insulina (IDE) (Selkoe, 2001, Neuron, 32, 177-180) .

Un objeto de la presente invención fue proporcionar anticuerpos dirigidos contra globulómeros Aβ que permitieran mejorar el desempeño cognitivo de un paciente sometido a inmunoterapia, y que al mismo tiempo reaccionaran solamente con una pequeña porción del péptido Aβ completo en el cerebro. Se espera que esto prevenga una alteración sustancial del equilibrio de Aβ en el cerebro y resulte en menos efectos colaterales (por ejemplo, se ha observado una reducción cuestionable desde el punto de vista terapéutico del volumen del cerebro en el estudio de inmunización activa con péptidos Aβ en una condición de agregación fibrilar (prueba ELAN con AN1792) ) . Más aún, en esta prueba se observaron efectos colaterales severos en forma de meningoencefalitis.

La presente invención soluciona este problema al proporcionar anticuerpos específicos... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo que comprende una cadena variable pesada (VH) y ligera (VL) en el que los dominios de CDR de cadena variable pesada y ligera comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes conjuntos de CDR:

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es humanizado.

Conjunto de CDR 1 Secuencia de Aminoácidos

VH CDR-H1 SYGVH

VH CDR-H2 VIWRGGRIDYNAAFMS

VH CDR-H3 NSDV

VL CDR-L1 KSSQSLLDIDGKTYLN

VL CDR-L2 LVSKLDS

VL CDR-L3 WQGTHFPYT

Conjunto de CDR 2

VH CDR-H1 SYVMH

VH CDR-H2 YIYPYNDGTKYNEKFKG

VH CDR-H3 TVEGATWDGYFDV

VL CDR-L1 KSSQSLLYSKGKTYLN

VL CDR-L2 LVSKLDS

VL CDR-L3 VQGTHFPHT

Conjunto de CDR 3

VH CDR-H1 SYAMS

VH CDR-H2 SIHNRGTIFYLDSVKG

VH CDR-H3 GRSNSYAMDY

VL CDR-L1 RSTQTLVHRNGDTYLE

VL CDR-L2 KVSNRFS

VL CDR-L3 FQGSHVPYT

Conjunto de CDR 4

VH CDR-H1 TFYIH

VH CDR-H2 MIGPGSGNTYYNEMFKD

VH CDR-H3 AKSARAAWFAY

VL CDR-L1 RSSQSWQSNCNTYLE

VL CDR-L2 KVSNRFS

VL CDR-L3 FQGSHVPPT

Conjunto de CDR 5

VH CDR-H1 TFYIH

VH CDR-H2 MIGPGSGNTYYNEMFKD

VH CDR-H3 AKSARAAWFAX

VL CDR-L1 RSSQSVVQSNGNTYLE

VL CDR-L2 KVSNRFS

VL CDR-L3 FQGSHVPPT

Conjunto de CDR 6

VH CDR-H1 TFYIH

VH CDR-H2 MIGPGSGNTYYNEMFKD

VH CDR-H3 AKSHRAAWFAY

VL CDR-L1 RSSQSVVQSNGNTYLE

VL CDR-L2 KVSNRFF

VL CDR-L3 FQGSHVPPT

Conjunto de CDR 7

VH CDR-H1 DYEMV

VH CDR-H2 YINSGSGTIHYADTVKG

VH CDR-H3 TLLRLHFDY

VL CDR-L1 KSSQSLFYSRNQKNFLA

VL CDR-L2 WASTGES

VL CDR-L3 QQYFSYPWT

Conjunto de CDR 8

VH CDR-H1 DYEMV

VH CDR-H2 YISSGSRTIHYADTVKG

VH CDR-H3 TLLRLHFDY

VL CDR-L1 RSSQSLFYRSNQKNFLA

VL CDR-L2 WASTRES

VL CDR-L3 QQYYSYPWT

Conjunto de CDR 9

VH CDR-H1 DYEMV

VH CDR-H2 YISSGSRTIHYADTVKG

VH CDR-H3 TLLRLHFDY

VL CDR-L1 RSSQSLFYRSNQKNFLA

VL CDR-L2 WASTRES

VL CDR-L3 QQYYSYPWT

Conjunto de CDR 10

VH CDR-H1 DYVIH

VH CDR-H2 YINPYNDGTQYNEKFKG

VH CDR-H3 VEGGTWDGYFDV

VL CDR-L1 Secuencia de aminoácidos de VL CDR-L1 del anticuerpo monoclonal que puede obtenerse de un hibridoma designado por el número de depósito de la Colección Americana de Cultivos Tipo PTA-7851

VL CDR-L2 Secuencia de aminoácidos de VL CDR-L2 del anticuerpo monoclonal que puede obtenerse de un hibridoma designado por el número de depósito de la Colección Americana de Cultivos Tipo PTA-7851

VL CDR-L3 Secuencia de aminoácidos de VL CDR-L3 del anticuerpo monoclonal que puede obtenerse de un hibridoma designado por el número de depósito de la Colección Americana de Cultivos Tipo PTA-7851

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una región constante humana. 5

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo posee un patrón de glucosilación humano.

5. Porción de unión a antígeno de un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 10

6. La porción de unión a antígeno de la reivindicación 5, donde la porción es un fragmento Fab, un fragmento F (ab’) 2

o un fragmento Fv monocatenario del anticuerpo.

7. Ã?cido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de una cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector que comprende un ácido nucleico aislado de la reivindicación 7.

9. Célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 8. 20

10. Método para producir un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 9 en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir el anticuerpo.

11. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo aceptable para el uso farmacéutico.

12. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6

para uso en el tratamiento o prevención, o diagnóstico de una amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer o 30 síndrome de Down.

13. Método para diagnosticar una amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer o síndrome de Down, que comprende proporcionar una muestra del sujeto sospechoso de padecer una amiloidosis, poner en contacto la muestra con un anticuerpo o una porción de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y detectar la formación de un complejo que comprende el anticuerpo o la porción de unión a antígeno con un antígeno, donde la presencia del complejo indica una amiloidosis en el sujeto.