Método basado en matrices para detección de variaciones en el número de copias en el locus HLA para la determinación genética de susceptibilidad al desarrollo de malformaciones venosas en los segmentos extracraneales de las venas cefalorraquídeas y matriz del mismo.

Un método para el diagnóstico in vitro de un riesgo de desarrollar al menos una malformación venosa cefalorraquídea extracraneal en un paciente,

comprendiendo dicho método detectar el número global de variaciones en el número de copias extragénicas (CNV) en el locus HLA-DRA del cromosoma 6p21.

Método basado en matrices para detección de variaciones en el número de copias en el locus HLA para la determinación genética de susceptibilidad al desarrollo de malformaciones venosas en los segmentos extracraneales 5 de las venas cefalorraquídeas y matriz del mismo

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a un método basado en matrices para la detección de variaciones en el número de copias en el locus HLA para la determinación genética de susceptibilidad al desarrollo de malformaciones venosas en los segmentos extracraneales de las venas cefalorraquídeas asociadas con la esclerosis múltiple. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a un método de diagnóstico genético para la determinación del riesgo de correlación genotipo-fenotipo de desarrollo de malformaciones venosas asociadas con la esclerosis múltiple.

Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple es la enfermedad neurológica más frecuente en la población adulta joven catalogada en trastornos neurodegenerativos de etiología desconocida. Se ha propuesto que causas inflamatorias, infecciosas, y

autoinmunes tienen un papel patogénico en esta enfermedad, aunque la relación entre estos factores y la etiología de la enfermedad aún no se ha esclarecido.

Desde el punto de vista genético, estudios en gemelos y hermanos sugieren que los genes de susceptibilidad pueden desempeñar un papel en esta enfermedad. La esclerosis múltiple tiene, de hecho, un componente hereditario clínicamente significativo.

Se realizó un estudio de asociación del genoma completo con el fin de identificar alelos asociados con el riesgo de esclerosis múltiple [7]. Un ensayo de desequilibrio de transmisión de 334.923 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en 931 tríos de la familia reveló 49 SNP que tienen una asociación con la esclerosis múltiple. Los alelos de 30 IL2RA e IL7RA y aquellos en el locus HLA se identifican como factores de riesgo hereditarios para la esclerosis múltiple. Sin embargo, la detección los loci de susceptibilidad es un punto de partida importante, pero no aclara cuáles son exactamente los genes implicados en la transmisión de la enfermedad y a través de qué mecanismos moleculares. Además, no se ha demostrado una correlación entre variación del genotipo y fenómenos de fenotipo. Por dicha razón, es necesario localizar con precisión los loci de susceptibilidad y también correlacionarlos con la función de los genes componentes.

Se han realizado estudios de genes candidatos y estudios de asociación de todo el genoma, así como la detección de variaciones en el número de copias (CNV) en matrices basadas en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que implican más de cien mil marcadores y se han identificado varios loci de susceptibilidad en el genoma humano,

siendo el locus HLA en 6p21.32 el locus asociado con más seguridad [1-6]. Se han descrito algunos otros loci de susceptibilidad posibles, aunque de significación estadística incierta [7, 8].

Cuando se usan matrices basadas en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) e incluso cuando los controles se asignan al azar con precisión, se pueden producir errores indetectables vinculados especialmente a los orígenes 45 geográficos de la población, a las diferencias conocidas en la densidad de los SNP, que dependen de los diferentes cromosomas humanos o incluso de regiones genómicas implicadas. Estos errores pueden engrosar las diferencias aparentemente significativas entre pacientes y controles (inflación genómica) que generan falsos positivos o falsos negativos, y que finalmente dificultan un verdadero reconocimiento de los loci asociados [8].

Con el fin de superar este problema "potencial", se tiene que analizar un número enorme de individuos tal como lo recomienda el Wellcome Trust Case Control Consortium y tal como se informó recientemente [8], para obtener datos imparciales y para replicar las asociaciones en los loci identificados. Sin embargo, los propios Autores concluyen que se requieren estudios funcionales.

Sumario de la invención Por lo tanto, teniendo en cuenta estas premisas, se siente la necesidad de mejores soluciones que permitan una detección fiable de factores de predisposición genética de los pacientes para el desarrollo de malformaciones venosas asociadas con la esclerosis múltiple.

El objetivo de la presente divulgación es proporcionar dichas soluciones mejoradas.

De acuerdo con la invención, el objetivo anterior se consigue gracias a la materia objeto recordada específicamente en las reivindicaciones siguientes, que se entiende que forman una parte fundamental de la presente divulgación.

Una realización de la presente divulgación proporciona un método para el diagnóstico in vitro del riesgo de desarrollo de al menos una malformación venosa cefalorraquídea extracraneal en un paciente, que comprende la etapa de detectar el número global de variaciones en el número de copias extragénicas (CNV) en el locus HLA-DRA del cromosoma 6p21, en el que el número de CNV extragénicas se correlaciona con dicho riesgo.

La presente divulgación desvela un kit para realizar dicho método de diagnóstico. Más específicamente, el kit comprende sondas de CGH que cubren la región del locus HLA-DRA para la detección de las CNV en el cromosoma 6p21 en el ADN genómico de los pacientes.

Una realización adicional de la presente divulgación se refiere a una matriz de CGH que cubre totalmente la región del locus HLA-DRA para ver la detección de las CNV en el cromosoma 6p21 en el ADN genómico de los pacientes.

Los datos que se desvelan en el presente documento demuestran una correlación significativa entre el número de CNV encontradas en la región de HLA-DRA y el número de malformaciones venosas, más específicamente de malformaciones venosas cefalorraquídeas crónicas, identificadas en los pacientes. La presente divulgación demuestra que el número de CNV polimórficas múltiples identificadas en el locus HLA son determinantes implicados posiblemente en la manifestación fenotípica para esta nueva asociación de malformaciones venosas/esclerosis múltiple.

Breve descripción de las figuras La invención se describirá a continuación, solamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas de los dibujos, en las que:

-Figuras 1A y 1B: Distribución genómica de las CNV Conocidas entre los pacientes estudiados a lo largo del

locus HLA-DRA. En el gráfico se indica el nucleótido de partida para cada CNV. En color blanco se resaltan las regiones de los genes de HLA. -Figura 2: Ejemplificación de malformación venosa estenosante asociada con MS. A) Estenosis significativa

(flecha) de la vena yugular interna izquierda (L IJV) . B) Obstrucción membranosa de la salida de la vena Ácigos (o AZY) en la vena cava superior (SVC) . -Figuras 3 a 5: Análisis de regresión lineal. Una correlación significativa entre el número de CNV (figura 3) , CNV

intragénicas (figura 4) y CNV extragénicas (figura 5) y se encontró el número de malformaciones venosas detectadas por medio de venografía selectiva (r = 0, 53, r2 = 0, 28, p < 0, 05) . -Figura 6: Número de CNV totales (A) , intragénicas (B) y extragénicas (C) conocidas indicadas en la Base de datos de las Variantes Genómicas por paciente. -Figura 7: Enlaces funcionales de los genes conocidos dentro de la red del locus HLA en trastornos de neurodegeneración, esclerosis múltiple e inmunidad (A) y angiogénesis y rutas de formación venosa (B) . -Figura 8: El perfil de CGH identificado en el paciente PF como ejemplo. La alteración múltiple del área del

genoma es muy evidente.

Descripción detallada de la invención En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión exhaustiva de las realizaciones. Las realizaciones se pueden poner en práctica sin uno o más de los detalles específicos, o con otros métodos, componentes, materiales, etc En otros casos, estructuras bien conocidas, materiales, u operaciones no se muestran ni se describen en detalle para evitar el oscurecimiento de aspectos de las realizaciones.

A lo largo de toda la presente memoria descriptiva, la referencia a "una realización" o "una realización" se refiere a que un elemento, estructura o característica determinados que se describen en conexión con la realización se incluye en al menos una realización. Por lo tanto, no todas las apariciones de las expresiones "en una realización" o "en una realización", en diversos lugares a lo largo toda la presente memoria descriptiva, se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los elementos, estructuras o características particulares... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico in vitro de un riesgo de desarrollar al menos una malformación venosa cefalorraquídea extracraneal en un paciente, comprendiendo dicho método detectar el número global de variaciones en el número de copias extragénicas (CNV) en el locus HLA-DRA del cromosoma 6p21.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha detección se realiza en una muestra de ADN genómico de dicho paciente.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha detección de dichas variaciones en el número de copias en el cromosoma 6p21 se realiza usando un método de CGH, una método de matriz de CGH

o una matriz basada en polimorfismos de un solo nucleótido.

4. Matriz de CGH del locus HLA-DRA del cromosoma 6p21, en la que dicha matriz comprende un soporte sólido y una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que cubren el locus HLA-DRA del cromosoma 6p21, en la que dichas sondas están relacionadas con dicho soporte sólido, y en la que dicha pluralidad de sondas de oligonucleótidos tiene una resolución de una sonda cada 160 bp de la secuencia de nucleótidos del locus HLA-DRA del cromosoma 6p21 y dichas sondas de oligonucleótidos son oligonucleótidos 60mer.

5. Matriz de CGH de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha pluralidad de sondas de oligonucleótidos comprende 43102 sondas.

6. Matriz de CGH de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que dicha matriz tiene un formato de 4x44 K.