Marcadores para epitelio transformado y potenciales dianas para terapia de cáncer del complejo gingivo-bucal.

Uso de un panel de marcadores proteicos en el cribaje de cáncer del complejo gingivo-bucal,

en donde el panel de marcadores proteicos comprende 14-3-3 σ, lactato deshidrogenasa y apolipoproteína A-I.

Marcadores para epitelio transformado y potenciales dianas para terapia de cáncer del complejo gingivo-bucal Campo de la invención

[1] La presente invención se refiere a la identificación de marcadores para epitelio transformado de cáncer del complejo gingivo-bucal que serían útiles para detección y prognosis y como potenciales dianas para terapia.

Antecedentes de la Invención y Estado de la Técnica

[2] Globalmente, el cáncer oral es la sexta malignidad común con aproximadamente 5. nuevos cánceres orales y faríngeos diagnosticados anualmente (Parkin, Pisani, & Ferlay, 1993, Estlmates of the Worlwlde incidente of elghteen majorcancers in 1985. Int J Cáncer, 54(4), 594-66.), y tres cuartos de éstos son del mundo en desarrollo. En el Tata Memorial Hospital (Dlnshaw & Ganesh, 25 Annual Report-21, Hospital Based Cáncer Registry, Tata Memorial Hospital.), de Mumbal, que registra ~ 3. casos de cáncer de todas las partes del país, el cáncer de la cavidad oral constituye el 12% de la carga de cáncer total. Los cánceres de la mucosa bucal, que es un sitio principal en el complejo gingivo-bucal, son un 59% de los de la cavidad oral. La mayoría de estos cánceres se presentan en la etapa III y IV. La supervivencia de cinco años es muy baja y aproximadamente un 6% de los pacientes vuelven con recurrencia locorregional.

[3] El perfilado molecular de los tumores es percibido como herramienta para identificar prospectivos pronosticadores o dianas de drogas, con potencial translacional. Para cánceres de la cabeza y del cuello, se han documentado alteraciones de genes que se correlacionan con los en la actualidad totalmente aceptados sellos de cáncer, es decir, con la proliferación celular no regulada, la apoptosis reducida, la inmortalidad, la invasión y metástasis y la anglogénesls (Hunter, Parklnson, & Harrison, 25 "Profiling early head and neck cáncer", Nat Rev Cáncer, 5(2), 127-135; Nagpal & Das, 23 "Oral cáncer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and explorlng the future dlrectlons for ¡ts effective management", Oral Oncol, 39(3), 213-221; Patel, Leethanakul, & Gutkind, 21 "New approaches to the understanding of the molecular basis of oral cáncer", Crit Rev Oral Boil Med, 12(1), 55-63; Schliephake, 2.3 " Prognosctlc relevante of molecular" markers of oral cancer-a review, Int J Oral Maxillofac Surg, 32(3), 233-245; Warnakulasuriya, 22." en Genetics of Human Cáncer, Chapter 51, 773-784). Los artículos de la literatura presentan inconsistencia en su relevancia clínica (Schliephake, 23 "Prognostic relevante of molecular" markers of oral cancer-a review. Int J Oral Maxillofac surg, 32(3), 233-245). Un extenso análisis de datos de mlcromatrices ("microarrays") de cáncer oral realizado en la literatura por Shillitoe [ www.upstate.edu/microb/shillite/Microarray_Oral_Cancer_Genes.HTM ] demuestra que está en el 93% la ¡rreproducibilidad de las alteraciones de la expresión de mRNA. Los estudios en ambas compilaciones no han tomado en consideración los subsidios de la cavidad oral, las diferencias de metodología, el tamaño de muestra y el grado de representación de células tumorales en los especímenes. Incluso con estas limitaciones se siguen los datos de matriz para contar con información que pueda ser utilizada para el manejo del cáncer (Sotiriou, Lothaire, Dequanter, Cardoso, & Awada, 24 "Molecular profiling of head and neck tumors. Curr Opin Oncol, 16(3), 211-214). Partiendo de estos estudios anteriores, está siendo cada vez más evidente que la identificación de perfiles moleculares sitio-específicos es una necesidad para la diagnosis y/o prognosis.

[4] Se ha descrito análisis proteómico usando espectrometría de masas-electroforesis en gel bidimensional (2DE- MS) para cáncer de la mucosa bucal (Chen, He, Yuen, & Chiu, 24 "Proteomics of buccal squamous cell carcinoma: the ¡nvolvement of múltiple pathways in tumorigenesis". Proteomics, 4(8), 2465-2475), carcinoma de células escamosas de la cavidad oral (OSCC) (Lo et al., 27 "Identification of over-expressed proteins in oral squamous cell carcinoma (OSCC) patlents by clinical proteomic analysis", Clin Chim Acta, 376(1-2), 11-17) y cáncer de la lengua (Baker et al., 25 "Proteome-wlde análisis of head and neck squamous cell carcinomas using laser-capture microdissection and tándem mass spectrometry", Oral Oncol, 41(2), 183-199; He, Chen, Kung, Yuen, & Chiu, 24 "Identification of tumor- assoclated proteins ¡n oral tongue squamous cell carcinoma by proteomics", Proteomics, 4(1), 271-278). En el estudio con cánceres de la mucosa bucal (Chen et al., 24 "Proteomics of buccal squamous cell carcinoma: the ¡nvolvement of múltiple pathways ¡n tumorigenesis", Proteomics, 4(8), 2465-2475), se investigaron las diferencias de expresión proteica entre tejido normal y tejido tumoral usando muestras de tejido íntegro; el tejido tumoral que constaba de aproximadamente un 7% de células tumorales y tejido normal con < 15% de epitelio y el resto con músculo y estroma circundante. En el estudio con OSCC (Lo et al., 27 "Identification of over-expressed proteins in oral squamous cell carcinoma (OSCC) patlents by clinical proteomic analysis", Clin Chim Acta, 376(1-2), 11-17), el tejido tumoral usado contenía > 9% de células tumorales. El porcentaje de epitelio normal no era definido. Baker et al. (Baker et al., 25 "Proteome-wide análisis of head and neck squamous cell carcinomas using laser-capture microdissection and tándem mass spectrometry", Oral Oncol, 41(2), 163-199) han descrito un perfil proteico para carcinoma de células escamosas (SCC) de la lengua obtenido tras microdisección por captura con láser seguida de análisis por LC-MS/MS. La abundancia relativa de una proteína en epitelio normal y tumoral fue cuantificada mediante el número de veces que fue identificada una proteína en cada uno de los mismos. Gires et al (Gires et al., 24 "Profile identification of disease- associated humoral antigens using AMIDA, a novel proteomics-based technology", Cell Mol Life Sci, 61(1), 1198-127)

y Rauch et al (Rauch et al., 24 "Allogenic antibody-mediated Identification of head and neck cáncer antlgens", Blochem Biophys Res Commun, 323(1), 156-162) han identificado antígenos específicos de cáncer oral que provocan respuesta inmune en pacientes. Sin embargo, en estos estudios gran parte del trabajo es con líneas celulares tumorales y tumores de la cabeza y del cuello sin subsitios definidos. En ninguno de los estudios anteriormente mencionados se ha evaluado la relevancia de la coexpresión y la capacidad de un conjunto de proteínas expresadas diferencialmente para distinguir entre epitelio normal, benigno y transformado. En un estudio muy reciente (Roesch-Ely et al., 27 "Proteomic analysis reveáis successive aberrations in protein expression from healthy mucosa to invasive head and neck cáncer", Oncogene, 26(1), 54-64) el análisis proteómico usando SELDI-TOF-MS ha revelado sucesivas aberraciones en expresión proteica de mucosa sana a cáncer invasivo de cabeza y cuello. En este estudio, sin embargo, se usó tejido íntegro con células tumorales que iban de un 4% a un 9% de distintos sitios de la cabeza y del cuello.

[5] Alevizos I. et al. (Oncogene 21, 2, 6196-624) dan a conocer un método de microdisección por captura con láser y análisis de micromatrices para el perfilado de la expresión génica in vivo de cánceres orales.

[6] La US 25/21488 A1 da a conocer un método para diagnosticar el carcinoma de células escamosas de la cabeza y del cuello midiendo los niveles de CD44 soluble.

[7] Deshpande M. S. et al. (PD.57, « Marginal mandibulectomy for gingivo buccal complex cancers », 1 de enero de 25, 82-83) dan a conocer un estudio de pacientes que fueron sometidos a mandibulectomía marginal.

[8] La US 27/27479 A1 hace pública la identificación de biomarcadores diagnósticos y prognósticos para metástasis de cáncer de lengua.

[9] Nuestro estudio analiza perfiles proteómicos de carcinoma de células escamosas (SCC) del complejo gingivo- bucal (GBC) y de tejido clínicamente no maligno adyacente de los mismos individuos usando epitelio disecado manualmente. Un conjunto de proteínas diferenciadoras ha sido generado a partir de la valoración cuantitativa relativa de perfiles de electroforesis en gel bidimensional de los epitelios normales y tumorales disecados. Ésta es la primera vez, para cáncer de un subsitio de la cavidad oral, que la coexpresión de once proteínas se ha descubierto que distingue el epitelio transformado del normal, con buena especificidad y sensibilidad, según valoración efectuada mediante análisis de conglomerados y adicional confirmación con análisis de Características Operativas del Receptor (ROC). Los mínimos números de proteínas que... [Seguir leyendo]

Uso de un panel de marcadores proteicos en el cribaje de cáncer del complejo gingivo-bucal, en donde el panel de marcadores proteicos comprende 14-3-3 o, lactato deshldrogenasa y apolipoproteína A-I.

Uso de un panel de marcadores proteicos en la detección in vitro de cáncer del complejo gingivo-bucal, en donde el panel de marcadores proteicos comprende 14-3-3 o, lactato deshidrogenasa y apolipoproteína A-I.

Uso de un panel de marcadores proteicos según la reivindicación 1 o 2, en donde el panel de marcadores proteicos adicionalmente comprende alfa-enolasa, prohibitina, catepsina D, proteína tumoral controlada translacionalmente-1, tropomiosina y 14-3-3 Z, (YWHAZ).

Método para identificar un panel de marcadores proteicos como los definidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el método los pasos de:

a. prever una primera muestra que comprenda tejido tumoral de la zona gingivo-bucal de la cavidad oral de paciente con cáncer;

b. prever una segunda muestra que comprenda un tejido adyacente o contralateral no maligno de la zona gingivo-bucal de la cavidad oral de pacientes con cáncer;

c. microdisecar las células epiteliales transformadas de secciones congeladas del tejido maligno y de la capa epitelial no transformada de secciones congeladas del tejido no maligno;

d. separar proteínas de los Usados preparados a partir de células epiteliales mlcrodisecadas transformadas y no transformadas de (c) mediante electroforesis en gel bidimensional y efectuar tinción con plata;

e. comparar los perfiles proteicos de las células epiteliales mlcrodisecadas de las muestras en c) y d) para generar una preselección de manchas de proteína comúnmente expresadas en epitelio tanto normal como transformado;

f. recortar las manchas en gel de proteínas preseleccionadas de un gel bidimensional teñido con plata de células epiteliales mlcrodisecadas transformadas;

g. desteñir y secar el gel y digerir la proteína con tripsina;

h. analizar los péptidos secados eluidos mediante espectroscopia de masas para obtener las identidades de las proteínas;

i. comparar la expresión de cada mancha de proteína preseleccionada en células epiteliales no malignas y transformadas mediante métodos conocidos para identificar un conjunto de marcadores proteicos para el epitelio transformado que constan de los miembros del grupo que consta de 14-3-3 o, lactato deshidrogenasa, apolipoproteína A-I, alfa-enolasa, prohibitina, catepsina D, proteína tumoral controlada translacionalmente-1, tropomiosina y 14-3-3 Z, (YWHAZ);

j. identificar manchas de proteína diferenciadora clave usando Análisis Discriminante Lineal.

Kit para detectar cáncer del complejo gingivo-bucal, en donde el kit comprende:

I. un conjunto de anticuerpos contra las proteínas 14-3-3 o, lactato deshidrogenasa y apolipoproteína A-I; y

II. reactivos de detección inmune.

Kit según la reivindicación 5, en donde el kit comprende:

I. un conjunto de anticuerpos contra las proteínas lactato deshidrogenasa, alfa-enolasa, prohibitina, catepsina D, apolipoproteína A-I, proteína tumoral controlada translacionalmente-1, 14-3-3 o, tropomiosina y 14-3-3 Z, (YWHAZ); y

II. reactivos de detección inmune.

Kit según la reivindicación 5 o 6, que comprende:

a. los anticuerpos (I) en solitario o en combinación, en salina tamponada que contiene agentes quelantes, inhibidor de proteasa y detergente no iónico;

b. un anticuerpo secundario marcado con biotina/peroxidasa de rábano picante o FITC o Cy5;

c. tampón de lavado tal como salina tamponada con contenido de detergente no iónico;

d. reactivo de detección tal como estreptavidina-HRP con diaminobencidina (DAB), o solamente DAB, o un detector fluorescente.

Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la detección de cáncer del complejo gingivo- bucal en una muestra biológica.