Lisis y transcripción inversa mejoradas para la cuantificación de ARNm.

Método para la realización de una RT-PCR para la amplificación de un ARN objetivo que comprende las etapas de:

a) lisis de una muestra biológica que se supone que contiene dicho ARN objetivo en un recipiente de muestra con un tampón de lisis que comprende entre 0,05 M y 1 M de un tiocianato de guanidina,

b) diluir dicha muestra hasta el punto en que dicho tiocianato de guanidina esté presente durante la etapa c) en una concentración de entre aproximadamente 10 y 60 mM en dicho recipiente de muestra,

c) sin ninguna etapa de purificación intermedia, retrotranscribir dicho ARN objetivo en presencia de una mezcla de cebadores de síntesis de primera hebra de ADNc en una primera hebra de ADNc, consistiendo dicha mezcla en cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y/o cebadores aleatorios y/o cebadores específicos del objetivo, en dicho recipiente de muestra,

d) amplificar dicha primera hebra de ADNc sometiendo dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado

Lisis y transcripciïn inversa mejoradas para la cuantificaciïn de ARNm

ïmbito tïcnico La presente invenciïn proporciona un procedimiento para mediciones de ARNm. Mediante el uso de una PCR cuantitativa, junto con procedimientos optimizados de recolecciïn celular, anïlisis y transcripciïn inversa, el mïtodo permite el estudio del nïmero de transcritos, las distribuciones y las correlaciones, y la inducciïn gïnica incluso a nivel de una ïnica cïlula.

Antecedentes de la tïcnica anterior

Las cïlulas de una poblaciïn son en muchos aspectos ïnicas por sus caracterïsticas, incluso en un cultivo o un tejido aparentemente homogïneo. Los niveles de expresiïn gïnica muestran importantes variaciones entre una cïlula y otra, debido a fuentes de factores externos (extrïnsecos) e internos (intrïnsecos) [1]. Asimismo, cuando se exponen a estïmulos idïnticos, las cïlulas a menudo se comportan estocïsticamente [1 - 7]. Esto significa que no puede asumirse que los datos obtenidos a partir de una poblaciïn de cïlulas reflejen el comportamiento de la cïlula individual. Se ha sugerido que las cïlulas pueden responder a los estïmulos mediante explosiones en la actividad

transcripcional y operan como un interruptor binario [4 - 9]; es decir, en una forma de todo o nada.

Para determinar si los transcritos son expresados en paralelo (elevada expresiïn al mismo tiempo) o antiparalelo (uno estï alto cuando el otro estï bajo) , se requiere un anïlisis de la transcripciïn a nivel de la cïlula individual. Cuando se analizan grupos de cïlulas al mismo tiempo se pierde informaciïn importante. Por ejemplo, no es posible discriminar entre un pequeïo cambio en la transcripciïn gïnica que se produce en cada cïlula por oposiciïn a cambios importantes ïnicamente en unas pocas cïlulas. Adicionalmente, la heterogeneidad celular de los tejidos hace difïcil el anïlisis especïfico del tipo celular. Estas cuestiones se resuelven mediante mediciones en las cïlulas individuales.

Una cïlula eucariota tïpica contiene aproximadamente 25 pg de ARN, del cual menos del 2 % es ARNm [10]. Esto se corresponde con unos pocos cientos de miles de transcritos de los º10.000 genes que son expresados en cada cïlula en cualquier punto temporal en particular. Las tïcnicas de imagen tales como la fluorescencia mïltiple en la hibridaciïn in situ (FISH) pueden monitorizar la actividad transcripcional gïnica espacialmente en una cïlula individual mediante el marcaje de ARNm especïficos [3 - 4] y puede aplicarse a cïlulas vivas para proporcionar

imïgenes resueltas temporalmente de la complejidad de la maquinaria de transcripciïn. Los niveles de proteïnas en las cïlulas individuales se han medido cuantitativamente en bacterias [1, 7] y en levaduras [6] mediante el uso de proteïnas indicadoras fluorescentes. Para un anïlisis completo del transcriptoma de una cïlula individual se usan micromatrices, precedidas por una amplificaciïn no especïfica del ADNc [10 - 11]. El mïtodo mïs extendido para el anïlisis del ARNm de una cïlula individual es la reacciïn en cadena de la polimerasa con transcripciïn inversa (RT

PCR) , y la relacionada RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) . Esta tïcnica ofrece una sensibilidad, precisiïn e intervalo dinïmico superiores en comparaciïn con los mïtodos alternativos de mediciïn del ARNm [12 13]. El nïmero de transcritos que puede ser fïcilmente analizado en la cïlula individual es pequeïo, pero la preamplificaciïn del ADNc aumenta en gran medida este nïmero [13 - 14].

Sin embargo, los protocolos para el anïlisis de cïlulas individuales que existen en la tïcnica hasta ahora sïlo son ïtiles con respecto a la detecciïn de objetivos expresados abundantemente. Estos mïtodos no proporciona la sensibilidad requerida para detectar ARNm objetivo que son expresados a un nivel comparativamente bajo.

Descripciïn breve 50 Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invenciïn se refiere a un mïtodo para la realizaciïn de una RT-PCR para la amplificaciïn de un ARN objetivo que comprende las etapas de a) en un recipiente de muestra, la lisis de una muestra biolïgica que consiste ïnicamente en unas pocas cïlulas 55 que se supone que contienen dicho ARN objetivo con un tampïn de lisis que comprende entre 0, 05 M y 1 M de un agente que caotrïpico b) en el mismo recipiente de muestra, diluir dicha muestra hasta el punto en que el agente caotrïpico estï presente durante la etapa c) en una concentraciïn de aproximadamente entre 10 y 60 mM

c) en el mismo recipiente de muestra, sin ninguna etapa de purificaciïn intermedia, retrotranscribir dicho ARN objetivo en presencia de una mezcla de cebadores de la sïntesis de la primera hebra de ADNc en una primera hebra de ADNc, consistiendo dicha mezcla en cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y/o cebadores aleatorios

d) amplificar dicha primera hebra de ADNc sometiendo dicha muestra a mïltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

Preferiblemente, la amplificaciïn de dicha primera hebra de ADNc durante dicho protocolo de termociclado es 5 monitorizada en tiempo real.

Este mïtodo es aplicable tïpicamente si la muestra comprende ïnicamente un nïmero limitado de cïlulas, es decir, no mïs de 1.000 cïlulas, y preferiblemente menos de 100 cïlulas. En particular, el mïtodo es aplicable incluso si la muestra comprende ïnicamente menos de 10 cïlulas o una ïnica cïlula.

Preferiblemente, dicho agente caotrïpico es tiocianato de guanidina. Alternativamente dicho agente caotrïpico puede elegirse de entre un grupo que consiste en clorhidrato de guanina, cianato de potasio y sulfato de amonio.

Preferiblemente, el tampïn de lisis comprende entre aproximadamente 0, 2 y 0, 5 M de agente caotrïpico.

Tambiïn preferiblemente, durante la etapa c) , es decir durante la reacciïn de la transcriptasa inversa, el agente caotrïpico estï presente en una concentraciïn de aproximadamente 10 - 60 mM, mïs preferiblemente de entre 30 y 50 mM y lo mïs preferiblemente de aproximadamente 40 mM.

Tambiïn preferiblemente, la etapa a) comprende la adiciïn de un carbohidrato, que es preferiblemente un azïcar o un dextrano, con objeto de evitar la evaporaciïn de bajos volïmenes de muestra.

Opcionalmente, la reacciïn de la transcriptasa inversa puede realizarse en presencia de entre un 0, 5 y un 2 % de un detergente no iïnico, que es preferiblemente NP 40. En una forma de realizaciïn, dicho detergente no iïnico puede ya estar aïadido a la muestra durante la etapa a) .

En una forma de realizaciïn, la etapa a) se realiza durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente o incluso menos.

En otra forma de realizaciïn, la incubaciïn de la etapa a) puede realizarse a entre 55 - 85 ïC en presencia de proteinasa K. Entonces, entre la etapa a) y la etapa b) , o la etapa b) y la etapa c) , la muestra puede incubarse durante al menos 5 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 80 ïC y 90 ïC con objeto de destruir cualquier actividad residual de la proteinasa K.

Tambiïn de acuerdo con la presente invenciïn, la etapa a) puede realizarse en presencia de una ADNasa especïfica de hebra doble, preferiblemente ADNasa I o nucleasa de gamba. En el caso de usar la ADNasa I, es ventajoso si, entre la etapa a) y la etapa b) , o la etapa b) y la etapa c) , la muestra se incuba durante al menos 5 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 80 ïC y 90 ïC.

Opcionalmente, la muestra se congela a unas temperaturas de entre aproximadamente -20 ïC y -80 ïC inmediatamente antes de la etapa b) . Eso significa que despuïs de congelar, ya no se aïade ningïn aditivo segïn se ha desvelado anteriormente antes de la etapa b) .

De acuerdo con la presente invenciïn es muy preferible que dicha mezcla de cebadores de sïntesis de ADNc 45 comprenda tanto cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A secuencia como cebadores aleatorios.

El cebador aleatorio es habitualmente un cebador aleatorio hexïmero. Los cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A son habitualmente cebadores de oligo-dT o cebadores de Oligo-dU. En una forma de realizaciïn preferida, dichos cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y los cebadores aleatorios estïn presentes en cantidades iguales. En otra forma de realizaciïn preferida, que es compatible con la mencionada anteriormente, dichos cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y los cebadores aleatorios estïn presentes a unas concentraciones de entre 1 !M y 5 !M cada uno. Son muy preferidas las concentraciones de aproximadamente 2, 5 !M de cada uno.

En una forma de realizaciïn muy especïfica adecuada para el anïlisis de muestras... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo para la realizaciïn de una RT-PCR para la amplificaciïn de un ARN objetivo que comprende las etapas de:

a) lisis de una muestra biolïgica que se supone que contiene dicho ARN objetivo en un recipiente de muestra con un tampïn de lisis que comprende entre 0, 05 M y 1 M de un tiocianato de guanidina, b) diluir dicha muestra hasta el punto en que dicho tiocianato de guanidina estï presente durante la etapa c) en una concentraciïn de entre aproximadamente 10 y 60 mM en dicho recipiente de muestra,

c) sin ninguna etapa de purificaciïn intermedia, retrotranscribir dicho ARN objetivo en presencia de una mezcla de cebadores de sïntesis de primera hebra de ADNc en una primera hebra de ADNc, consistiendo dicha mezcla en cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y/o cebadores aleatorios y/o cebadores especïficos del objetivo, en dicho recipiente de muestra, d) amplificar dicha primera hebra de ADNc sometiendo dicha muestra a mïltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

2. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicha muestra biolïgica consiste en no mïs de 1.000 cïlulas, preferiblemente en no mïs de 100 cïlulas, y lo mïs preferiblemente es una ïnica cïlula.

3. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 2, en el que dicho tampïn de lisis comprende entre aproximadamente 0, 2 y 0, 5 M de agente caotrïpico.

4. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 3, en el que durante la etapa c) dicho agente caotrïpico estï

presente en una concentraciïn de entre aproximadamente 30 y 50 mM, y preferiblemente de aproximadamente 40 25 mM.

5. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 4 en el que la etapa a) se realiza en presencia de un detergente no iïnico que es preferiblemente NP40, y en el que dicho detergente no iïnico tiene durante la etapa c) una V/V del 0, 5 al 2 %.

6. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 5, en el que la etapa a) comprende la adiciïn de un carbohidrato, que es preferiblemente un azïcar o un dextrano.

7. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 6, en el que la etapa a) se realiza durante al menos 5 minutos a la 35 temperatura ambiente o por debajo de la temperatura ambiente.

8. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 7, en el que la etapa a) se realiza durante al menos 5 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 55 ïC y 85 ïC, preferiblemente en presencia de proteinasa K.

9. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 8, en el que entre la etapa a) y la etapa b) , o entre la etapa b) y la etapa c) , la muestra se incuba durante al menos 5 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 80 ïC y 90 ïC.

10. Mïtodo de acuerdo con la reivindicacione.

7. 9, en el que la etapa a) se realiza en presencia de una ADNasa especïfica de hebra doble, preferiblemente ADNasa I o nucleasa de gamba. 45

11. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 10, en el que entre la etapa a) y la etapa b) , o entre la etapa b) y la etapa c) , la muestra se incuba durante al menos 5 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 80 ïC y 90 ïC.

12. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciï.

7. 11, en el que antes de la etapa b) la muestra se congela a unas temperaturas de entre aproximadamente -20 ïC y -80 ïC.

13. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciones 1 - 12, en el que dicha mezcla de sïntesis de ADNc comprende cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y cebadores aleatorios. 55

14. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 13, en el que los cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y los cebadores aleatorios estïn presentes en unas cantidades molares esencialmente iguales.

15. Mïtodo de acuerdo con la reivindicacione.

13. 14, en el que dichos cebadores que hibridan con una secuencia 60 de poli-A y los cebadores aleatorios estïn presentes en unas concentraciones de entre 1 !M y 5 !M cada uno.

16. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 13, en el que dichos cebadores que hibridan con una secuencia de poli-A y los cebadores aleatorios estïn presentes en unas concentraciones de aproximadamente 2, 5 !M cada uno.