Levadura y procedimiento de producción de ácido L-láctico.

Levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis,

en la que el gen que codifica la L-lactato deshidrogenasa es un gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis IdhA, IdhB o IdhC.

Levadura y procedimiento de producción de ácido L-láctico SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de ácido L-láctico. La presente invención se refiere además a una levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa. La presente invención se refiere además a un procedimiento de producción de ácido L-láctico que comprende cultivar la levadura que tiene un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa.

TÉCNICA ANTERIOR

Dentro del actual creciente interés de la sociedad por la utilización y la reutilización eficaz de los recursos, están atrayendo especialmente la atención los polímeros producidos a partir de materias primas vegetales. En particular, se ha conocido recientemente que el ácido poliláctico, un producto de una materia prima de origen vegetal, tiene unas propiedades excelentes.

El ácido láctico, la materia prima para el ácido poliláctico, se ha producido mediante el cultivo de un microorganismo, denominado generalmente como bacteria láctica. Entre los ejemplos típicos de las bacterias lácticas se incluyen especies de Lactobacillus y Lactococcus. Debido a que estas bacterias lácticas generalmente muestran un excelente rendimiento respecto al azúcar, pero son menos resistentes a los ácidos, para la acumulación de una sustancia ácida tal como ácido láctico en una gran cantidad, debe llevarse a cabo el cultivo a la vez que la solución de cultivo se neutraliza, por ejemplo, con un álcali tal como carbonato cálcico, hidróxido amónico o hidróxido sódico.

Sin embargo, un proceso de este tipo da una sal de lactato, tal como lactato sódico o lactato cálcico por el proceso de neutralización con un álcali, lo que hace necesario un tratamiento para convertir la sal de lactato de nuevo en ácido láctico en la etapa de purificación posterior y, de este modo, provoca un coste adicional.

De este modo, para la reducción del coste de neutralización, se ha propuesto la producción de ácido láctico mediante levadura resistente a los ácidos (véase los documentos de patente 1 a 5 y los documentos que no son patentes 1 a 3) . Las levaduras no producen naturalmente ácido láctico y, por lo tanto, para la producción de ácido láctico por la levadura, se deben introducir un gen de codificación de una L-lactato deshidrogenasa, y una enzima de conversión de ácido pirúvico en ácido L-láctico, (a continuación, abreviado como gen L-ldh) en la levadura por una técnica de recombinación genética.

Se han estudiado genes L-ldh bovinos, tal como el gen L-ldh para su introducción en la levadura (véase los documentos de patente 3 y 5, y los documentos que no son patentes 1 a 3) , y se ha descrito que son más favorables que los genes L-ldh derivados de bacterias lácticas. Los genes L-ldh derivados de bovino tienen un rendimiento menor respecto al azúcar de ácido L-láctico y, de este modo, existía una necesidad de nuevas mejoras de rendimiento con respecto al azúcar (véase el documento no patente 3) . Además, se ha estudiado también la mejora de la productividad de ácido L-láctico mediante mutación del gen derivado de la levadura. Sin embargo, la mutación del gen derivado de levadura dio lugar frecuentemente a desventajas tales como el alargamiento del periodo de fermentación y la disminución de la velocidad de consumo de azúcar (véase los documentos de patente 3 y 6) .

Tal como se ha descrito anteriormente, la producción de ácido L-láctico mediante levadura es un procedimiento útil. Sin embargo, existe una necesidad de una mejora adicional de la productividad.

Documento de Patente 1: Solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública (JP-A) Nº 2001-204.464 Documento de Patente 2: JP-A N º 2001 -204.468 Documento de Patente 3: Solicitud de Patente Japonesa de Publicación Nacional (abierta a inspección pública) Nº 2001 -516584 Documento de Patente 4: JP-A N º 2003-93060 Documento de Patente 5: JP-A N º 2003-259878 Documento de Patente 6: JP-A N º 2.006-006.271 Documentos no de patente 1: Danilo Porro y otros, Biotechnol. Prog, 11: págs. 294-298 (1955) Documento no de patente 2: Danilo Porro y otros, Applied and Environmental Microbiology, 65 (9) : p. 4211-4211 (1999) Documento no de patente 3: Satoshi Saitoh y otros, Applied and Environmental Microbiology, 71 (5) : p. 2789-2792 (2005)

Secuencias de ARNm de la lactato deshidrogenasa A1 de Xenopus laevis (ldha2) secuencia completa (1999-06-30) , cadena M de lactato deshidrogenasa A1 de Xenopus laevis (LDH-A) secuencia completa (1999-07-01) y el clon de ADNc de lactato deshidrogenasa MGC:53139 IMAGE:5542650, secuencia completa (2003-01-30) son extraíbles de la base de datos EMBL. Se hace referencia además a H. Mannen y otros, Evidencia molecular para un clado de tortugas (”Molecular evidence for a clade in turtles”) Molecular Phylogenetic and evolution, volumen 13, 1999, págs.

144-148, y a S. L. Klein y otros, Herramientas genéticas y genómicas para la investigación en Xenopus: La iniciativa NIH Xenopus (“Genetic and genomic tools for Xenopus research: the NIH Xenopus initiative”) , Developmental Dynamics 2002, volumen 225, págs. 384-391.

Los siguientes documentos describen la producción de levadura recombinante mediante la inserción de ldh exógena (lactato deshidrogenasa) dentro de las células de levadura: documentos WO03/102152 A2, US 2003/0228671 A1, US 6429006 B1, US 2003/016611479 A1, US 6485947 B1.

CARACTERÃ?STICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención es una levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis tal como se define en la reivindicación 1.

Otra realización preferente de la presente invención es 15

(1) una levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis tal como se define en la reivindicación 1, que tiene una alcohol deshidrogenasa variante tal como se define en la reivindicación 5, o

(2) una levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus

laevis tal como se define en la reivindicación 1, que carece del gen que codifica la piruvato descarboxilasa 1 y tiene un gen de piruvato descarboxilasa 5 variante en el que parte de la secuencia de ADN del gen que codifica la piruvato descarboxilasa 5 de tipo salvaje se ha eliminado, insertado, sustituido y/o agregado.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un gráfico esquemático que muestra un ejemplo del procedimiento para la preparación de un fragmento de PCR para la introducción del gen L-ldh en el cromosoma para su utilización en la presente invención.

La figura 2 es un gráfico que muestra el plásmido pTRS11, un ejemplo del plásmido de expresión para su utilización 30 en la presente invención.

La figura 3 es un gráfico que muestra el plásmido pTRS57, un ejemplo del plásmido de expresión para su utilización en la presente invención.

EXPLICACIÓN DE LOS NUMERALES

1: Secuencia homóloga corriente arriba del lugar de introducción deseado (lugar de adición)

2: Secuencia común 3: gen marcador de selección de levadura 4: Secuencia homóloga corriente arriba del lugar de introducción deseado (lugar de adición)

5: Fragmento de PCR para la introducción del gen L-ldh en el cromosoma MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

En la presente invención, el gen de L-ldh representa un gen que codifica la proteína que tiene una actividad de conversión de nicotinamida adenina dinucleótido reducida (NADH) y el ácido pirúvico en nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) oxidada y ácido L-láctico. El gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa (gen L-ldh) para su utilización en la presente invención es un gen L-ldh de Xenopus laevis tal como se define en la reivindicación 1.

Los tres tipos de isoformas del gen de codificación de L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis (gen L-ldh) , ldhA, ldhB, y ldhC, son conocidos, y cualquiera de ellos se pueden utilizar en la presente invención, pero preferentemente es el gen ldhA.

Específicamente, el gen de codificación de L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis (gen L-ldh) según la 55 presente invención es preferentemente el gen L-ldh que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Id. Sec. Nº

2.

Los genes que codifican L-lactato deshidrogenasa (gen L-ldh) de Xenopus laevis según la presente invención incluyen polimorfismo genético generado mediante mutagénesis. En la presente descripción, el polimorfismo 60 genético significa un cambio parcial en la secuencia de ADN de un gen causado por... [Seguir leyendo]

1. Levadura que comprende un gen introducido que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis, en la que el gen que codifica la L-lactato deshidrogenasa es un gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa de 5 Xenopus laevis IdhA, IdhB o IdhC.

2. Levadura según la reivindicación 1, en la que el gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa de Xenopus laevis es IdhA y tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Id. Sec. Nº 2.

3. Levadura, según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa está introducido en una posición corriente abajo de un promotor que permite la expresión del gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa.

4. Levadura, según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen que codifica una L-lactato deshidrogenasa está

introducido en el cromosoma para su expresión en una posición corriente abajo del gen promotor de la piruvato descarboxilasa 1.

5. Levadura según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además una alcohol deshidrogenasa variante que tiene una secuencia de aminoácidos en la que parte de la secuencia de aminoácidos de la alcohol deshidrogenasa de tipo salvaje está sustituida, suprimida, insertada y/o añadida, y la alcohol deshidrogenasa variante muestra sensibilidad a la temperatura de forma que la actividad de la alcohol deshidrogenasa intercelular desaparece o se reduce según el cambio en la temperatura de cultivo, en la que la alcohol deshidrogenasa variante es una alcohol deshidrogenasa variante que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las Id. Sec. Nº 40, 41 y 42.

6. Levadura, según la reivindicación 5, en la que la alcohol deshidrogenasa variante muestra sensibilidad a una temperatura de cultivo de 34ºC o superior.

7. Levadura, según la reivindicación 5, en la que la alcohol deshidrogenasa variante muestra sensibilidad a una 30 temperatura de cultivo de 30ºC o superior.

8. Levadura, según la reivindicación 5, en la que la alcohol deshidrogenasa variante es una alcohol deshidrogenasa variante que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la alcohol deshidrogenasa 1 de tipo salvaje que se muestra en la Id. Sec. Nº 39 están sustituidos,

eliminados, insertados y/o añadidos.

9. Levadura, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la levadura pertenece al género Saccharomyces.

10. Levadura, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la levadura pertenece al género Saccharomyces cerevisiae.

11. Procedimiento de producción de ácido L-láctico, que comprende el cultivo de la levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10. 45

12. Procedimiento de producción de ácido L-láctico, que comprende el cultivo de la levadura, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, a 25 hasta 37ºC.

13. Procedimiento de producción de ácido L-láctico, que comprende el cultivo de la levadura, según cualquiera de 50 las reivindicaciones 1 a 10, a 30 hasta 34ºC.