Un procedimiento para la producción en masa de una región Fc de inmunoglobulina con residuos de metionina iniciales eliminados.

Un procedimiento de producción de una región Fc de inmunoglobulina libre de un residuo de metionina codificada por un codón de iniciación en una escala en masa,

que comprende:

preparar un vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc de inmunoglobulina recombinante compuesta de una región Fc de inmunoglobulina unida a un extremo N terminal de la misma a una región bisagra de la inmunoglobulina por medio de un enlace peptídico;

transformar un E. coli con el vector de expresión recombinante para crear un transformante;

cultivar el transformante para expresar la región Fc de inmunoglobulina como un cuerpo de inclusión;

aislar y purificar la región Fc de inmunoglobulina del cuerpo de inclusión; y

solubilizar y replegar el fragmento Fc de inmunoglobulina,

en el que dicha región bisagra de inmunoglobulina tiene cisteína, serina o prolina como aminoácido inicial del extremo N terminal.

Un procedimiento para la producción en masa de una región Fc de inmunoglobulina con residuos de metionina iniciales eliminados

Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una región Fc de inmunoglobulina monomérica o dimérica libre de residuos de metionina iniciales en una escala de masa.

Técnica anterior

Con las ventajas en ingeniería genética, se han desarrollado y utilizado un gran número de fármacos de proteínas. Susceptibles a desnaturalización o degradación proteolítica en el cuerpo, los fármacos de proteínas, sin embargo, son difíciles de mantener en concentraciones y títulos in vivo durante un periodo de tiempo largo. Es importante una mejora en la estabilidad de las proteínas in vivo, que puede dar lugar al mantenimiento de las concentraciones in vivo de los fármacos de proteínas en niveles adecuados no sólo para promover la eficacia del tratamiento, sino también para ayudar a los pacientes que necesitan inyecciones frecuentes de sus fármacos de proteínas, en términos de conveniencia y costes.

Se han realizado muchos esfuerzos para potenciar la estabilidad in vivo de los fármacos de proteínas durante largo tiempo, ejemplificada cambiando la formulación de proteínas, fusionando una proteína a otra proteína, o uniendo química o biológicamente un polímero adecuado a la superficie de una proteína.

Una técnica de este tipo es preparar una proteína de fusión con el fragmento Fc de inmunoglobulina.

El fragmento Fc media en las funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , así como la capacidad de unión a antígeno, que es la única función de las inmunoglobulinas. Además, el fragmento Fc contiene una secuencia que participa en la unión al receptor Fc neonatal (FcRn) , que desempeña un papel en la regulación de los niveles de IgG en suero incrementando el transporte de IgG materna a los neonatos y la semivida de la IgG (Ghetie y Ward, Immunology Today

18: 592-598, 1997) , y la secuencia regula la interacción entre proteína A y proteína G. Por medio de la fusión de este fragmento Fc con una proteína terapéutica, se han realizado muchos estudios para potenciar la estabilidad de la proteína terapéutica.

Por ejemplo, la patente coreana n.º 249572 divulga una proteína de fusión preparada uniendo una región Fc de cadena pesada de IgG1 (Fc) en un extremo amino terminal de la misma a un extremo carboxilo terminal de una proteína, tal como un receptor de IL4, un receptor de IL7, un receptor de G-CSF o un receptor de EPO, y produciendo la proteína de fusión resultante en células de mamífero. La patente de los EE. UU. N.º 5.605.690 describe una proteína de fusión que comprende un receptor del factor de necrosis tumoral fusionado en su extremo carboxilo terminal a un derivado de Fc de IgG1 humana, produciéndose la proteína de fusión en células animales. Además, Tanox Inc. informó, en las patentes de los EE. UU. N.º 5.723.125 y 5.908.626, de una molécula híbrida que comprende interferón alfa o beta humano que está unido en su extremo carboxilo terminal a Fc de IgG4 humana natural por medio de un enlazador peptídico, y se produce en células animales. Lexigen Inc., como describe en la publicación de la solicitud internacional PCT N.º WO 00/69913 preparó un Fc de IgG1 natural unido en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de interferón humano por recombinación genética sin el uso de un enlazador y produjo la proteína de fusión en células animales. La publicación de patente de los EE. UU. N. 20030082679 divulga una proteína de fusión con una semivida en suero prolongada, que comprende G-CSF humano unido en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de Fc de IgG1 y se produce en células animales. La publicación de patente de los EE. UU. N. 20010053539, la patente de los EE. UU. N. 6, 030, 613, las publicaciones de solicitud internacional PCT N.º WO 99/02709 y WO 01/03737 y la patente europea N.º 0464533B1 divulga una proteína de fusión Fc con una semivida en suero más larga que una proteína natural, que comprende un Fc de IgG1 o derivado de Fc unido en su extremo amino terminal por medio de un enlazador peptídico al extremo carboxilo terminal de EPO humana, TPO, hormona de crecimiento humana o interferón beta humano, produciéndose la proteína de fusión Fc en células animales.

Estas proteínas de fusión Fc, como se describe anteriormente, incrementan la semivida en suero de proteínas diana, pero conlleva problemas relacionados con la mediación de las funciones efectoras por el fragmento Fc (patente de los EE. UU. N.º 5.349.053) . A través de las funciones efectoras del fragmento Fc, fijan complementos o se unen a células que expresan FcγRs, dando lugar a la lisis de células específicas, e inducen la producción y secreción de varias citocinas que inducen la inflamación, dando lugar a una inflamación no deseada. Además, la fusión crea una nueva secuencia de aminoácidos en una región de conexión entre el fragmento Fc y el compañero de proteína, lo que podría inducir potencialmente respuestas inmunitarias si se administra durante mucho tiempo.

A este respecto, se han realizado muchos esfuerzos para preparar una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina que tenga una semivida en suero larga pero que sea deficiente en funciones efectoras. Cole et al. informó de que, cuando los residuos aminoacídicos de la región CH2 en las posiciones 234, 235 y 237, conocidos por desempeñar un papel importante en la unión a receptores Fc, se reemplazan con alanina para producir así un derivado Fc que tenga una afinidad de unión reducida a receptores Fc, se inhibe la actividad de ADCC (Cole et al., J. Immunol.

159: 3613-3621, 1997) . Sin embargo, en todas estas variantes, el Fc puede tener una inmunogenicidad o antigenicidad incrementada en comparación con el fragmento Fc humano natural debido a la presencia de aminoácido no adecuados, y puede perder funciones de Fc deseables.

De entre los procedimientos de deleción o reducción de funciones efectoras no deseables mientras se mantienen concentraciones en suero altas de una inmunoglobulina, uno de ellos se basa en retirar restos de azúcar de la inmunoglobulina. Como se describe en la patente de los EE. UU. N. 5.585.097, se puede preparar un derivado de anticuerpo aglucosilado como anticuerpo anti-CD3 reemplazando un residuo glucosilado de anticuerpos, el residuo asparagina en la posición 297 del dominio CH2, con otro aminoácido. Este derivado de anticuerpo aglucosilado presenta funciones efectoras reducidas, pero aún retiene su afinidad de unión al receptor FcRn, sin cambios en su semivida en suero. Sin embargo, este derivado también es problemático en cuanto a que se reconoce potencialmente como un material exógeno y es rechazado por el sistema inmunitario debido a la producción de una construcción recombinante novedosa que tiene una secuencia anormal. La publicación de patente de los EE. UU. N.º 20030073164 divulga un procedimiento de producción de un derivado de Fc usando E. coli carente de capacidad de glucosilación para preparar un anticuerpo terapéutico deficiente en funciones efectoras.

La compañía americana Amgen Inc. describió, en la patente de los EE. UU. N.º 6.660.843 y en las publicaciones de patente de los EE. UU. N.º 20040044188 y 20040053845, un derivado de Fc de IgG1 humana que tiene deleciones de aminoácidos en los cinco primeros residuos aminoacídicos de la región bisagra, que está fusionada al extremo amino o carboxilo terminal de una proteína terapéutica o una proteína terapéutica imitada por un péptido, y la producción del mismo usando un huésped de E. coli. Sin embargo, esta proteína de fusión que no tiene una secuencia señal se expresa como los cuerpos de inclusión, y por tanto debe someterse a un procedimiento de replegado adicional. Este procedimiento de replegado de proteína reduce los rendimientos, y, en especial en una proteína presente como un homodímero o un heterodímero, reduce de forma marcada la producción de dímeros. Además, cuando una proteína no tiene una secuencia señal se expresa en E. coli, se añade un residuo de metionina al extremo N terminal del producto de expresión debido a la característica del sistema de expresión de proteína de E. coli. Los productos de expresión mencionados anteriormente de Amgen Inc. tienen un residuo de metionina N terminal, que puede inducir respuestas inmunitarias tras la administración repetida o excesiva al cuerpo. Además, puesto que estas moléculas de fusión se expresan en forma de proteína de fusión en E. coli uniendo un gen que codifica una proteína terapéutica... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una región Fc de inmunoglobulina libre de un residuo de metionina codificada por un codón de iniciación en una escala en masa, que comprende: preparar un vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc de inmunoglobulina recombinante compuesta de una región Fc de inmunoglobulina unida a un extremo N terminal de la misma a una región bisagra de la inmunoglobulina por medio de un enlace peptídico;

transformar un E. coli con el vector de expresión recombinante para crear un transformante;

cultivar el transformante para expresar la región Fc de inmunoglobulina como un cuerpo de inclusión;

aislar y purificar la región Fc de inmunoglobulina del cuerpo de inclusión; y

solubilizar y replegar el fragmento Fc de inmunoglobulina,

en el que dicha región bisagra de inmunoglobulina tiene cisteína, serina o prolina como aminoácido inicial del

extremo N terminal.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región Fc de inmunoglobulina está aislada en una forman monomérica o dimérica.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región bisagra tiene dos o más secuencias de aminoácidos consecutivas derivadas de la región bisagra de IgG, IgA, IgM, IgE, o IgD.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la región bisagra tiene dos o más secuencias de aminoácidos consecutivas, incluyendo cada una al menos un residuo de cisteína.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la IgG está seleccionada del grupo que consiste en lgG1, lgG2, lgG3 y lgG4.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la región bisagra tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 18, 19, 20, 21, 49, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región Fc de inmunoglobulina está seleccionada del grupo que consiste en regiones Fc de IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, y combinaciones e híbridos de las mismas.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la región Fc de inmunoglobulina es la región Fc de la IgG seleccionada del grupo que consiste en lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, y combinaciones e híbridos de las mismas.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región Fc de inmunoglobulina está compuesta de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en los dominios CH2, CH3 y CH4.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región Fc de inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33 , 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el transformante se transforma por un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el transformante está seleccionado del grupo que consiste en los números de acceso KCCM-10659P, KCCM-10660P, KCCM-10665P y KCCM-10666P.