Procedimiento para la producción de proteínas recombinantes glicosiladas.

Procedimiento para la producción de proteínas recombinantes glicosiladas.

La presente invención pertenece al campo de la producción de proteínas recombinantes. En concreto, se refiere a un procedimiento para la producción, en células humanas, de proteínas recombinantes con un patrón de glicosilación que se aproxima al obtenido con la línea celular de ovario de hámster chino. Se refiere asimismo a la proteína recombinante obtenible por dicho procedimiento y a su uso para la preparación de un medicamento.

Procedimiento para la producción de proteínas recombinantes glicosiladas Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la producción de proteínas recombinantes, más concretamente se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas recombinantes en células humanas con un patrón de glicosilación que se aproxima al obtenido con la línea celular derivada de células de ovario de hámster chino (línea celular CHO, Chinese Hamster Ovar y ) .

Antecedentes de la invención La demanda creciente de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, ha impulsado el desarrollo de biotecnologías para la producción eficiente y efectiva de biofármacos, de forma que cada vez son más las moléculas o proteínas terapéuticas producidas en sistemas biológicos (medicamentos biotecnológicos) .

Los medicamentos biotecnológicos similares, también denominados biosimilares o medicamentos biosimilares, se definen como aquellos productos medicinales de origen biotecnológico similares, pero no exactamente idénticos, a otros productos medicinales innovadores, la patente de los cuales ha expirado. Desde el punto de vista económico, el desarrollo de biosimilares presenta claras ventajas frente al de nuevos productos pues una caracterización preclínica similar a la del producto de referencia permite abordar solo las fases clínicas I y III, evitando el alto coste económico y el tiempo invertido en el desarrollo de la fase clínica II.

Los sistemas de expresión utilizados para la producción de medicamentos biotecnológicos se basan en vectores que permiten la clonación del gen que codifica la proteína de interés y su expresión en una célula hospedadora como bacterias, levaduras o líneas celulares eucariotas estables.

En un principio se utilizaron microorganismos modificados genéticamente para la producción de proteínas terapéuticas, sin embargo algunas de las proteínas producidas por ellos presentaban ciertas carencias estructurales que las hacían inadecuadas para su uso terapéutico humano. Uno de los principales inconvenientes de estos sistemas de producción es la falta de mecanismos que permitan generar modificaciones post-traduccionales que en muchos casos son fundamentales para la funcionalidad, tiempo de vida e inmunogenicidad de la biomolécula.

Estos problemas fueron resueltos con el uso de líneas celulares eucariotas estables, principalmente células de mamíferos, que sí son capaces de producir proteínas terapéuticas

mínimamente inmunogénicas, como por ejemplo la línea celular CHO. La línea celular CHO es el sistema de expresión por excelencia en la producción de medicamentos biotecnológicos, de manera que éstos presentan una serie de parámetros físico-químicos característicos de células CHO. Dentro de estos parámetros destaca el patrón de glicosilaciones típico de células CHO (referido de aquí en adelante como patrón o perfil de glicosilación CHO) , caracterizado por estar altamente fucosilado (alrededor del 90%) , y moderadamente galactosilado (aproximadamente 50%) , por presentar un ratio fucosilación/galactosilación entre 1, 3 y 1, 8, y por presentar una relación de especies glicanas mayoritarias de aproximadamente 1: 0, 80: 0, 26: 0, 18 para G0F: G1Fa: G1Fb: G2F, tomando como referencia la especie G0F (Xie et al. (Xie H., Chakraborty A., Ahn J., Yu Y. Q., Dakshinamoorthy D.P., Gilar M., Chen W., Skilton S.J. y Mazzeo J.R. (2010) mAbs 2:4, 379-394, ver página 388) ) .

La influencia del patrón de glicosilación en el comportamiento biológico de las proteínas es muy elevada, reflejo de ello es el uso de este patrón de glicosilación por las agencias regulatorias como parámetro crítico a evaluar en la aceptación o no de un producto biológico como posible biosimilar. Así, el uso de células distintas a las derivadas de hámster chino, por ejemplo líneas celulares humanas, para la producción de biosimilares de los productos de referencia producidos en la línea CHO, está limitado a la producción de proteínas que no presenten modificaciones post-traduccionales como interferones, vacunas, insulinas, etc.. Las células humanas generan una serie de modificaciones post-traduccionales propias de la línea celular humana y no de células de hámster. La principal consecuencia de estas diferencias es que los productos obtenidos a partir de células humanas no podrán ser considerados por las agencias reguladoras como medicamentos biosimilares a aquellos medicamentos de referencia que hayan sido producidos utilizando la línea celular CHO. Estos productos serán calificados como productos mejorados o “biobetters” (productos biotecnológicos mejorados respecto al producto de referencia) , siendo por lo tanto considerados como nuevo registro y debiendo pasar todas las fases clínicas pertinentes.

Por otro lado, cabe destacar que el uso de líneas células eucariotas no humanas, como la línea celular CHO, para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas puede causar problemas, como un plegamiento incorrecto de las proteínas que sucede durante o después de la traducción, el cual puede ser dependiente de la presencia de las proteínas chaperonas apropiadas. Un plegamiento aberrante puede conducir a una disminución o ausencia de actividad biológica de la proteína recombinante, a una disminución del tiempo de vida media en sangre e inclusive a un aumento de la inmunogenicidad. Además, algunas líneas células eucariotas no humanas, como la línea celular CHO, derivan de tumores lo que añade un riesgo adicional al trabajo con ellas y da como resultado procedimientos de aislamiento de proteínas recombinantes muy estrictos, con el objetivo de evitar la actividad transformante o el material tumorigénico en cualquier proteína u otras preparaciones.

Teniendo en cuenta todo lo anterior, los autores de la presente invención, han desarrollado un procedimiento para la producción en células humanas de proteínas recombinantes que,

sorprendentemente, tienen un patrón de glicosilación que se aproxima al obtenido con la línea celular CHO, proporcionando así un sistema de expresión óptimo para la producción de biosimilares.

Objeto de la invención Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento (procedimiento de la invención) para la producción de una proteína recombinante caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) adicionar un hidrolizado de proteínas de cereal a un medio de cultivo,

b) cultivar una célula humana transfectada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, en el medio de cultivo con hidrolizado de proteínas de cereal de la etapa a) , donde la célula humana no es una célula madre embrionaria humana, y

c) aislar la proteína recombinante producida por la célula humana en la etapa b) , donde la proteína recombinante contiene un perfil de N-glicanos caracterizado por que el glicano mayoritario es G0F, el cual representa entre un 30% y un 60% en función del contenido total de N-glicanos, y la relación de N-glicanos G0F:G1Fa:G1Fb:G2F es 1: 0, 400, 95: 0, 1-0, 40: 0, 02-0, 40.

En otro aspecto, se refiere al uso de un hidrolizado de proteínas de cereal para la producción de una proteína recombinante que contiene un perfil de N-glicanos caracterizado por que el glicano mayoritario es G0F, el cual representa entre un 30% y un 60% en función del contenido total de N-glicanos, y la relación de N-glicanos G0F:G1Fa:G1Fb:G2F es 1: 0, 40-0, 95: 0, 1-0, 40: 0, 02-0, 40, en una célula humana transfectada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, donde la célula humana no es una célula madre embrionaria humana.

Otro aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante que contiene un perfil de N-glicanos caracterizado por que el glicano mayoritario es G0F, el cual representa entre un 30% y un 60%, en función del contenido total de N-glicanos, y la relación de N-glicanos G0F:G1Fa:G1Fb:G2F es 1: 0, 40-0, 95: 0, 1-0, 40: 0, 02-0, 40, obtenible por el procedimiento de la invención. También se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha proteína recombinante y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y al uso de dicha proteína recombinante para la preparación de un medicamento.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra el perfil de N-glicanos de un anticuerpo monoclonal recombinante producido en distintas condiciones (fluorescencia (FLU) frente al tiempo de retención en minutos) . En los paneles A-D el anticuerpo ha sido producido en células humanas cultivadas durante 12 días en medio de cultivo sin suplementar (panel A, Medio) , suplementado... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de una proteína recombinante glicosilada caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) adicionar un hidrolizado de proteínas de cereal a un medio de cultivo,

b) cultivar una célula humana transfectada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante en el medio de cultivo con hidrolizado de proteínas de cereal de la etapa a) , donde la célula humana no es una célula madre embrionaria humana, y

c) aislar la proteína recombinante producida por la célula humana en la etapa b) , donde la proteína recombinante contiene un perfil de N-glicanos caracterizado por que el glicano mayoritario es G0F, el cual representa entre un 30% y un 60% en función del contenido total de N-glicanos, y la relación de N-glicanos G0F:G1Fa:G1Fb:G2F es 1: 0, 400, 95: 0, 1-0, 40: 0, 02-0, 40.

2. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde en la etapa a) se adiciona un hidrolizado de proteínas de cereal al medio de cultivo hasta alcanzar una concentración de hidrolizado de proteínas de cereal en el medio entre 1 g/L y 20 g/L.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el hidrolizado de proteínas de cereal es un hidrolizado de proteínas de trigo.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde en la etapa b) la célula humana es una célula de retina embrionaria humana.

5. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la célula de retina embrionaria humana es la célula ECAAC No 96022940.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína recombinante es un anticuerpo monoclonal.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde en la etapa b) la célula humana transfectada es la célula depositada en la HPACC con el número de depósito 12030701.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa b) se lleva a cabo en Fed-Batch o perfusión.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde en la etapa a) se adiciona albúmina al medio de cultivo.

10. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la albúmina se adiciona hasta alcanzar una concentración entre 0, 5 g/L y 20 g/L en el medio de cultivo.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, donde la albúmina es albúmina humana recombinante.

12. Uso de un hidrolizado de proteínas de cereal para la producción de una proteína recombinante glicosilada según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Uso de una combinación de un hidrolizado de proteínas de cereal y albúmina para la producción de una proteína recombinante glicosilada según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

A

B

t (min)

FIG. 1

t (min)

FIG. 1

A

10, 00 5, 00

% relativo

B-E

0, 00

C-E

-5, 00

A-E

-10, 00 -15, 00

B

% relativo

B-E

C-E

A-E 10

D-E

-10

FIG. 2

4 5 6 7 8 910 11 12

Días

FIG. 3

SEQUENCE LISTING

<110> CURAXYS S.L.

<120> Proteínas recombinantes glicosiladas y método de producción <130> 011/13

<160> 1 

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8841

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> vector v074

<400> 1 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat  60 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa  120 aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag atctcccgat cccctatggt gcactctcag  180 tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga  240 ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa  300 ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgctagg tggtcaatat  360 tggccattag ccatattatt cattggttat atagcataaa tcaatattgg ctattggcca  420 ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta  480 ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta  540 gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc  600 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg  660 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg  720 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa  780 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac  840 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg  900 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg  960 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca  1020 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta  1080 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac  1140 cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaagcttggt accgagctcg  1200 gatccgccac catggagtgg tccggcgtgt tcatgttcct gctgtccgtg accgctggcg  1260 tgcactccga ggtgcagctg gtcgagtctg gcggcggact ggtgcagcct ggcggctccc  1320 tgcggctgtc ctgcgccgcc tccggcttca acatcaagga cacctacatc cactgggtgc  1380 ggcaggcccc tggcaagggc ctggagtggg tggcccggat ctaccctacc aacggctaca  1440

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