Procedimiento para la obtención de insulinas mediante una mejor aireación del plegado.

Procedimiento para la preparación de insulinas o de un derivado de insulina con puentes de cisteína unidos correctamente,

a partir de un precursor de la insulina o del derivado de insulina, en donde el precursor se somete a un proceso de plegado en presencia de cisteína o hidrocloruro de cisteína y de un adyuvante caotrópico, después del cual se obtiene a partir del precursor, por escisión enzimática con tripsina o una enzima similar a la tripsina y, eventualmente, con el uso adicional de carboxipeptidasa B y la subsiguiente purificación en una resina adsorbente, una insulina o un derivado de insulina con puentes de cisteína unidos correctamente, caracterizado por que para la realización del proceso de plegado se llevan a cabo sucesivamente las siguientes etapas:

a) mezclar una suspensión acuosa del precursor de insulinas o derivados de insulina con una cantidad de cisteína o hidrocloruro de cisteína que proporciona 1 a 15 restos SH de la cisteína o del hidrocloruro de cisteína por resto de cisteína del precursor,

b) incorporar la suspensión del precursor que contiene cisteína o hidrocloruro de cisteína a una solución 4 a 9 molar del adyuvante caotrópico, a un valor de pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de aproximadamente 15 a 55ºC, y mantener la mezcla obtenida durante aproximadamente 10 a 60 minutos a esta temperatura, y

c) incorporar la mezcla a un valor de pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 5 a 30ºC a una cantidad de agua que produce una dilución de la concentración de cisteína o de hidrocloruro de cisteína en la mezcla a aproximadamente 1 a 5 mM y del adyuvante caotrópico a 0,2 hasta 1,0 M,

en donde, en la etapa (c), la mezcla se trata con gas en un recipiente, de manera que la concentración de oxígeno en la suspensión es de 1 a 15 mg/L.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/002843.

Solicitante: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BRUNINGSTRASSE 50 65929 FRANKFURT AM MAIN ALEMANIA.

Inventor/es: KELLER, REINHOLD, DR., RUBROEDER,FRANZ-JOSEF, HERBERT,HEIKE.

Fecha de Publicación: 29 de Octubre de 2014.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/62 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Insulinas.

PDF original: ES-2527693_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la obtención de insulinas mediante una mejor aireación del plegado

La presente invención se refiere a un procedimiento optimizado para la obtención de insulinas o derivados de insulina, con puentes de cistina unidos correctamente, en presencia de cisteína o hidrocloruro de cisteína y de un aditivo caotrópico, en donde el plegado tiene lugar en una mezcla de reacción en la que la proporción de volumen a superficie es mayor que 1 y/o la concentración de oxígeno es de 1 a 15 mg/L.

La insulina humana es una proteína que tiene dos cadenas de aminoácidos con un total de 51 restos de aminoácidos. En ambas cadenas de aminoácidos existen 6 restos de cisteína, en donde dos sendos restos de cisteína están unidos entre sí mediante un puente de disulfuro. En la insulina humana biológicamente activa, las cadenas A y B están unidas entre sí mediante dos puentes de cistina y, en la cadena A, existe un puente de cistina adicional. En una molécula de insulina humana existen, desde el punto de vista estadístico, 15 posibilidades para la formación de puentes de disulfuro. En la insulina humana biológicamente activa sólo se presenta una de las 15 posibilidades. Los siguientes restos de cisteína están unidos entre sí en la insulina humana:

A6-A 11

A 7 - B 7

A2-B 19

Las letras A y B representan las correspondientes cadenas de aminoácidos de insulina y el número indica la posición del resto de aminoácido, contado desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo de la correspondiente cadena de aminoácidos. También pueden formarse puentes de disulfuro entre dos moléculas de insulina humana, de manera que pueden existir muchos puentes de disulfuro diferentes que pasen fácilmente inadvertidos.

Un procedimiento conocido para preparar insulina humana se basa en el uso de proinsulina humana. La proinsulina humana es una proteína con una cadena lineal de aminoácidos de 86 restos de aminoácidos, en la que las cadenas A y B de la insulina humana están unidas entre sí a través de un péptido C con 35 restos de aminoácidos. La formación de los puentes de disulfuro existentes en la insulina humana se produce a través de un producto intermedio, en donde los restos de cisteína de la insulina humana están provistos de un grupo protector de azufre, por ejemplo un grupo S- sulfonato (-S-S3') (documento EP 37255). Se conoce, además, un procedimiento para la obtención de proinsulina con puentes de cistina unidos correctamente (Biochemistry, 6, (1968), páginas 622 a 629), derivada de proinsulina obtenida del páncreas porcino, en la que los restos de cisteína están presentes como restos tiol (-SH). Por la expresión "puentes de cistina unidos correctamente" se entienden los puentes de disulfuro que están presentes en la insulina biológicamente activa procedente de mamíferos.

Los procedimientos de tecnología genética permiten preparar en microorganismos un precursor de insulina o derivados de insulina, en especial proinsulina humana o proinsulina que posee una secuencia de aminoácidos y/o una longitud de cadena de aminoácidos que son divergentes de las de la insulina humana. Las proinsulinas preparadas en células de Escheríchia coli genéticamente modificada carecen de puentes de cistina unidos correctamente. Un procedimiento para la obtención de insulina humana con E. coli (documento EP 55945) consiste en las siguientes etapas procedimentales:

Fermentación de microorganismos - disgregación celular - aislamiento de la proteína de fusión - escisión del halogenuro de cianógeno de la proteína de fusión - aislamiento del producto de la escisión con la secuencia de proinsulina - protección de los restos de cisteína de la proinsulina con grupos S-sulfonato - purificación cromatográfica del S-sulfonato - formación de los puentes de cistina unidos correctamente - eliminación de las sales de la proinsulina - purificación cromatográfica de la proinsulina con puentes de cistina unidos correctamente - concentración de la solución de proinsulina - purificación cromatográfica de la solución concentrada de proinsulina - escisión enzimática de la proinsulina para obtener insulina humana - purificación cromatográfica de la insulina humana formada.

Los inconvenientes de este procedimiento son el número de etapas procedimentales y las pérdidas en las etapas de purificación, que determinan un bajo rendimiento de insulina. Debido a las múltiples etapas de la vía procedimental se debe contar con pérdidas considerables. En la etapa de la proteína de fusión aislada por escisión con halogenuro de cianógeno, sulfitolisis y purificación de la proinsulina hay que prever una pérdida de hasta 4% de proinsulina (documento EP 55945). En el curso de las subsiguientes etapas de purificación hasta el producto final se pueden producir pérdidas igualmente elevadas.

En la preparación por tecnología genética de insulina humana o derivados de insulina es posible alcanzar incrementos del rendimiento cuando se puede reducir sustancialmente el número de etapas del procedimiento.

Por los documentos EP 6372 A1 (o US 5.473.49) y EP 668292 A2 se conoce un procedimiento correspondientemente optimizado para la obtención de insulinas o derivados de insulina, en el que el precursor de insulina o el precursor del derivado de insulina cuyos puentes de cistina no están correctamente acoplados se transforman en presencia de un mercaptano, por ejemplo cisteína, y de al menos un adyuvante caotrópico, por ejemplo,

urea o hidrocloruro de guanidina, en un precursor de insulina o un precursor del derivado de insulina con puentes de cisteína unidos correctamente. En el procedimiento conocido, estas proteínas se disuelven inicialmente en soluciones acuosas de un adyuvante caotrópico o de mezclas de diferentes adyuvantes caotrópicos en muy baja concentración. A continuación, se combina la mezcla de proteínas con una solución acuosa de mercaptano.

De manera sorprendente, se ha encontrado ahora que es posible aumentar el rendimiento de precursores de insulina o derivados de insulina correctamente plegados y, por lo tanto, rebajar los tiempos de reacción para el proceso de plegado, cuando el precursor no se lleva a solución en una primera etapa con el adyuvante caotrópico, sino que inicialmente se incorpora mercaptano, a saber cisteína o hidrocloruro de cisteína, a la suspensión acuosa del precursor, y, sólo en una etapa posterior, se agrega a la solución del precursor una solución acuosa del adyuvante caotrópico y, por último, se lleva a efecto el plegado correcto del precursor por medio de la dilución de la mezcla hasta una concentración preferida de cisteína o hidrocloruro de cisteína, mediante la incorporación de la mezcla en una cantidad correspondiente de agua.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un precursor de insulinas o derivados de Insulina con puentes de cistina unidos correctamente, en presencia de cisteína o hidrocloruro de cisteína y de un adyuvante caotrópico, que se distingue por que se llevan a cabo sucesivamente las siguientes etapas:

a. Mezclar una suspensión acuosa del precursor de insulinas o derivados de insulina con una cantidad de cisteína o hidrocloruro de cisteína que proporcione 1 hasta 15 restos de SH de cisteína o del hidrocloruro de cisteína por resto de cisteína del precursor;

b. Incorporar la suspensión del precursor que contiene cisteína o hidrocloruro de cisteína en una solución 4 a 9 molar del adyuvante caotrópico, con un valor de pH de 8 a 11,5 y una temperatura de 15 a 55°C, y mantener la mezcla obtenida a esta temperatura durante aproximadamente 1 a 6 minutos, y

c. Incorporar la mezcla a un valor de pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 5 a 3°C a una cantidad de agua que determine una dilución de la concentración de la cisteína o del hidrocloruro de cisteína en la mezcla a aproximadamente 1 a 5 mM y del adyuvante caotrópico a ,2 hasta 1, M,

en donde, en la etapa (c), la mezcla se trata con gas en un recipiente, de modo que la concentración de oxígeno en la mezcla es de 1 a 15 mg/L,

en donde la proporción de volumen a superficie de la mezcla es mayor que 1 m, en especial mayor que 2 m, en especial mayor que 3 m, y la concentración de oxígeno en la mezcla es de 2 a 1 mg/L

Preferiblemente, el procedimiento también se distingue por que tiene lugar

en la etapa (a), la cantidad de cisteína o hidrocloruro de cisteína corresponde a una cantidad que proporciona 1 a 6 restos SH de la cisteína o del hidrocloruro de cisteína por resto de cisteína del precursor,

en la etapa (b), la incorporación de la suspensión del precursor que contiene cisteína o hidrocloruro de cisteína en una solución... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la preparación de insulinas o de un derivado de insulina con puentes de cisterna unidos correctamente, a partir de un precursor de la insulina o del derivado de insulina, en donde el precursor se somete a un proceso de plegado en presencia de cisteína o hidrocloruro de cisterna y de un adyuvante caotrópico, después del cual se obtiene a partir del precursor, por escisión enzimática con tripsina o una enzima similar a la tripsina y, eventualmente, con el uso adicional de carboxipeptidasa B y la subsiguiente purificación en una resina adsorbente, una insulina o un derivado de insulina con puentes de cisteína unidos correctamente, caracterizado por que para la realización del proceso de plegado se llevan a cabo sucesivamente las siguientes etapas:

a) mezclar una suspensión acuosa del precursor de insulinas o derivados de insulina con una cantidad de cisteína o hidrocloruro de cisteína que proporciona 1 a 15 restos SH de la cisteína o del hidrocloruro de cisteína por resto de cisteína del precursor,

b) incorporar la suspensión del precursor que contiene cisteína o hidrocloruro de cisteína a una solución 4 a 9 molar del adyuvante caotrópico, a un valor de pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de aproximadamente 15 a 55°C, y mantener la mezcla obtenida durante aproximadamente 1 a 6 minutos a esta temperatura, y

c) incorporar la mezcla a un valor de pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 5 a 3°C a una cantidad de agua que produce una dilución de la concentración de cisteína o de hidrocloruro de cisteína en la mezcla a aproximadamente 1 a 5 mM y del adyuvante caotrópico a ,2 hasta 1, M,

en donde, en la etapa (c), la mezcla se trata con gas en un recipiente, de manera que la concentración de oxígeno en la suspensión es de 1 a 15 mg/L.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proporción de volumen a superficie de la mezcla en la etapa (c) es mayor que 1.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la proporción de volumen a superficie de la mezcla es mayor que

4. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de oxigeno en la mezcla es de 2 a 1 mg/L.

5. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en la etapa (a) la cantidad de cisteína o hidrocloruro de cisteína corresponde a una cantidad que proporciona 1 a 6 restos SH de la cisteína o del hidrocloruro de cisteína por resto de cisteína del precursor,

en la etapa (b), tiene lugar la incorporación de la suspensión del precursor que contiene cisteína o hidrocloruro de cisteína en una solución 4 a 9 molar del adyuvante caotrópico a un valor de pH de 8 a 11 y a una temperatura de 3 a 45°C, y la mezcla obtenida se mantiene a esta temperatura durante 2 a 4 minutos, y

en la etapa (c), se produce la incorporación de la mezcla a un valor de pH de 8 a 11 y a una temperatura de 15 a 2°C a una cantidad de agua que produce una dilución de la concentración de cisteína o del hidrocloruro de cisteína en la mezcla a aproximadamente 1 a 5 mM y una concentración del adyuvante caotrópico de ,2 a 1, M.

6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el adyuvante caotrópico es guanidina, hidrocloruro de guanidina o urea.

7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la concentración del adyuvante caotrópico en la etapa (b) es de 7, a 9 M.

8. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la temperatura en la etapa (b) es de 4°C.

9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el valor de pH en la etapa (b) es de 1 a 11.

1. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el valor de pH en la etapa (c) es de 1 a 11.

11. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado por que, en la etapa (c), la cantidad de agua produce una dilución de la concentración de cisteína o del hidrocloruro de cisteína en la mezcla a 2,5 a 3, mM y una concentración de adyuvante caotrópico a ,5 M.

12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que la concentración del adyuvante caotrópico en la etapa (b) es de aproximadamente 8 M, la temperatura en la etapa (b) es de aproximadamente 4°C, el valor de pH en la etapa (b) es de aproximadamente 1,2, el valor de pH en la etapa (c) es de aproximadamente 1,6, y en la etapa (c) la cantidad de agua produce una dilución de la concentración de cisteína o de

hidrocloruro de cisteína en la mezcla a aproximadamente 2,5 a 3, M, y una concentración del adyuvante caotrópico de ,5 M.

13. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que el precursor de insulinas o derivados de insulina tiene la secuencia según la Fórmula general II

Rz-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A2)-R3 (II).

en la que significan

R2 a) un átomo de hidrógeno

R1	b) un resto de aminoácido del grupo de lisina (Lys) o arginina (Arg), o c) un péptido con 2 a 45 restos de aminoácidos que contiene el resto de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo carboxilo del péptido, un resto de fenilalanina (Phe) o un enlace covalente,
(B2-B29)	los restos de aminoácidos en las posiciones B2 a B29 de la cadena B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina con variaciones, eventualmente, en una o múltiples de estas posiciones,
Y	un resto de aminoácido codificable genéticamente,
X	a) un resto de aminoácido del grupo de histidina (His), lisina (Lys) o arginina (Arg), o b) un péptido con 2 a 35 restos de aminoácidos, que contiene el resto aminoácido de lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo N-terminal y en el extremo carboxilo del péptido, o c) un péptido con 2 a 35 aminoácidos codificables genéticamente, que contiene 1 a 5 restos de histidina,
(A2-A2)	los restos de aminoácidos en las posiciones A2 a A2 de la cadena B de insulina humana, insulina animal o de un derivado de insulina con variaciones eventualmente en una o múltiples posiciones

R3 un resto de aminoácido codificable genéticamente.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque en la Fórmula II significan R2 a) un átomo de hidrógeno o

R1	b) un péptido con 2 a 25 restos de aminoácidos, que contiene el resto de aminoácido arginina (Arg) en el extremo carboxilo del péptido, un resto de fenilalanina (Phe),
(B2-B29)	los restos de aminoácidos en las posiciones B2 a B29 de la cadena B de insulina humana
Y	un resto de aminoácido del grupo de alanina (Ala), treonina (Thr) o serina (Ser),
X	el resto de aminoácido arginina (Arg) o un péptido con la secuencia de aminoácidos de la cadena C de insulina humana,
(A2-A2)	los restos de aminoácidos en las posiciones A2 a A2 de la cadena B de insulina humana, y

R3 un resto de aminoácido del grupo de asparagina (Asn), serina (Ser) o glicina (Gly)

15. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque en la Fórmula II significan R2 a) un átomo de hidrógeno o

b) un péptido con 2 a 15 restos de aminoácidos, en cuyo extremo carboxilo se encuentra un resto de arginina (Arg),

un resto de fenilalanina (Phe),

(B2-B29)

los restos de aminoácidos en las posiciones B2 a B29 de la cadena B de insulina humana

Y	un resto de treonina (Thr),
X	el resto de aminoácido arginina (Arg) o un péptido con 2 a 35 restos de aminoácidos, en donde al comienzo y al final del péptido hay dos restos de aminoácidos básicos, en especial arginina (Arg) y/o lisina (Lys),
(A2-A2)	los restos de aminoácidos en las posiciones A2 a A2 de la cadena B de insulina humana, y
R3	un resto de aminoácido de asparagina (Asn) o glicina (Gly).

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