Inmunógenos desintoxicados de Escherichia coli.

Un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf 3526) de E.

coli que comprende una mutación con respecto a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona de una deleción completa o parte de un dominio de zinquina metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de la zinquina metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmunitaria sustancialmente similare en un sujeto como la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli.

CAMPO TÉCNICO

[1] Esta invención se refiere a la inmunización contra las cepas patógenas de Escherichia coli. ANTECEDENTES

[2] Las cepas de E. coli tradicionalmente se han clasificado como comensales o patógenos, y las cepas patógenas se subclaslflcan además como cepas intestinales o extra Intestina les. Las E. coli patógenas se discuten con más detalle en la referencia 1, y se pueden agrupar en diferentes patotlpos, es decir, un grupo de cepas de £. coli que causa una enfermedad común utilizando un conjunto común de factores de virulencia. La tipificación patogénica de las cepas es una técnica rutinaria que se realiza genotípica o fenotípicamente. Un método reciente de tipificación patogénica basado en el genotipo [2] utiliza un microarray de ADN.

[3] Entre las cepas Intestinales se conocen al menos seis patotipos bien descritos: enteropatógeno (EPEC), enterohemorrágico (EHEC), enteroagregativo (EAEC), enteroinvasivo (EIEC), enterotoxigénico (ETEC) y con adherencia difusa (DAEC).

[4] Las cepas patógenas extralntestlnales (o cepas "ExPEC" [3,4] de £. coli incluyen cepas uropatógenas (UPEC), cepas de meningitis neonatal (NMEC), y cepas asociadas con septicemia (SEPEC). ExPEC es la causa más común de Infecciones del tracto urinario y una de las principales causas de meningitis neonatal y sepsis neonatal en humanos que pueden causar graves complicaciones y muerte. Otros tipos de infecciones extralntestlnales Incluyen osteomielitis, Infecciones pulmonares, intraabdominales, de tejidos blandos, e infecciones asociadas a dispositivos intravasculares. Otro patotipo ExPEC no exclusivo de humanos es el patógeno aviar (APEC) que causa infecciones extralntestlnales en aves de corral.

[5] La mayoría de las vacunas anteriores de ExPEC se han basado en lisados celulares o en estructuras celulares. SOLCOUROVAC incluye diez bacterias diferentes inactivadas por calor incluyendo seis cepas ExPEC. URO - VAXOM es una vacuna en comprimidos que contiene lisados bacterianos liofilizados de 18 cepas seleccionadas de E. coli. Baxter Vaccines desarrolló una vacuna contra UTI basada en los pili de 6 a 1 cepas diferentes. Medlmmune desarrolló un producto denominado MEDI 516 basado en el complejo de adhesina FimH. Por el contrario, las referencias 5 y 6 describen inmunógenos específicos de cepas ExPEC que pueden ser utilizados como la base de vacunas definidas contra las cepas NMEC y UPEC.

[6] Un objeto de la Invención es proporcionar más y mejores antígenos para su uso en la inmunización contra las cepas patógenas de E. coli, y más particularmente contra los patotipos intestinales (por ejemplo, cepas EAEC, EIEC, EPEC y ETEC), así como los patotipos ExPEC y en particular antígenos que han sido detoxificados para permitir su uso como componentes de inmunización o que se han acortado sin reducir la respuesta inmune formulada para mejorar la expresión y purificación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[7] Uno de los muchos antígenos descritos en la referencia 5 se anota como el precursor del factor de colonización accesorio D ("AcfD") (orf3526) (SECs ID N°: 751 y 752; SEC ID N° 1 en la presente). La referencia 5 describe la secuencia de la cepa NMEC IHE334, y la presente invención se basa en la variantes del "precursor de AcfD" (orf3526) ExPEC que se han identificado en otros patotipos, incluyendo cepas APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC. A diferencia de la descripción de la referencia 5, estas variantes pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de patotipos intestinales. De este modo, la invención proporciona dichas variantes junto con su uso en la inmunización de pacientes contra las infecciones de E. coli. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento tiene una mayor solubilidad en comparación a la de longitud completa mientras que se mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento tiene toxicidad reducida en comparación con la proteína completa mientras que mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa mientras que tienen características mejoradas con respecto a la purificación cuando se expresa en E. coli.

Polipéptidos utilizados en la invención

[8] La invención presenta un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli que comprende una mutación en relación con la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del

polipéptido inmunogénico en comparación con la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona a partir de una deleción de todo o una parte del dominio zinquina - metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de zinquina - metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que el polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[9] La proteína AcfD (orf3526) de E. coli puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SECs ID N° 1 - 19.

[1] Ejemplos de mutaciones que disminuyen la toxicidad incluyen una deleción de todo o una parte del dominio zinquina - metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio zinquina - metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa. En ciertos casos, la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico. Una mutación puntual preferida es la sustitución del número de aminoácido 135 basado en base al alineamiento con la SEC ID N° 1.

[11] Las deleciones ejemplares incluyen la eliminación de, al menos, los últimos 1 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 2 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 3 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 4 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 5 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de £. coli, al menos, los últimos 6 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de £. coli, al menos, los últimos 7 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 75 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 758 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprenden, al menos, los primeros 1 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 2 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 3 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 4 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 5 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 6 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 7 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 75 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o, al menos, los primeros 76 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[12] La invención proporciona un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli, en el que el polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo entre las SECs ID N° 2 a 38, y 58 a 76;

(b) al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SECs ID N° 2 a 38 y 58 a 76; o

(c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1 alteraciones de aminoácidos individuales (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las SECs ID N° 2 a 38 y 58 a 76;

(d) cuando se alinea con cualquiera de las SECs ID N° 2 a 38, y 58 a 76 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde N - terminal a C - terminal (tal como un alineamiento que se extiende a p aminoácidos,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf 3526) de E. coli que comprende una mutación con respecto a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona de una deleción completa o parte de un dominio de zinquina metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de la zinquina metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmunitaria sustancialmente similare en un sujeto como la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli.

2. El polipéptido inmunogénico según la reivindicación 1, en el que la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SECs ID N° 1 - 19.

3. El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en el que la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico.

4. El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el residuo de unión a zinc es el aminoácido número 135 en base al alineamiento con la SEC ID N° 1.

5. El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que el polipéptido inmunogénico no comprende, al menos, los últimos 1 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 2 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 3 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 4 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 5 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 6 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 7 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 75 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 758 aminoácidos C - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprende, al menos, los primeros 1 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 2 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 3 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 4 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 5 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 6 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 7 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 75 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros, 76 aminoácidos N - terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

6. El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo entre las SECs ID N° 2 a 38, 58 a 76 y 77 a 95;

(b) de 1 a 1 alteraciones individuales de aminoácidos en comparación con las SECs ID N° 2 a 38, 58 a 76 y 77 a 95;

(c) al menos el 85 % de identidad de secuencia de cualquiera de las SECs ID N° 2 a 38, 58 a 76 y 77 a 95; o

(d) cuando se alinea con cualquiera de las SECs ID N° 2 a 38, 58 a 76 y 77 a 95 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde N - terminal a C - terminal tiene al menos xy aminoácidos alineados idénticos, donde x es 3; e y es ,75.

en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

7. El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el polipéptido inmunogénico contiene además una deleción con respecto a la proteína AcfD (orf3526) de E.coli que aumenta la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación con la proteína AcfD (orf3526) de E.coli en la que la deleción es la supresión de sustancialmente todos los aminoácidos N - terminales hasta la región gly- ser, la supresión completa o una parte de la repetición rica en prolina N - terminal, o ambos.

8. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 7, en el que la deleción es la supresión de, al menos, los primeros 2 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 3 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 38 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 4 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 5 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 6 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526)

de E. coli, al menos, los primeros 7 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 8 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 9 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los primeros 94 aminoácidos N - terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

9. El polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 en el que el polipéptido inmunogénico es aislado, purificado o recombinante.

1. El polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende además un adyuvante.

11. Un polinucleótido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. Una célula de £. coli, que contiene un plásmido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

13. Un componente de vacuna que comprende un polipéptido inmunogénico de la reivindicación 9.

14. Una vacuna que comprende un componente de vacuna de la reivindicación 13.

15. La vacuna de la reivindicación 14 que comprende además un adyuvante.

16. La vacuna de la reivindicación 14 o la reivindicación 15 que comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado entre: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetan, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno adicional de £. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y un antígeno de Klebsiella.

17. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9.

18. La composición inmunogénica de la reivindicación 17, que comprende además un adyuvante.

19. La composición inmunogénica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende (a) 1-12 % en volumen de un aceite metabolizable, y (b) de ,2 % a 2,5 % en peso de un agente emulsionante, en el que el aceite metabolizable del agente emulsionante está presente en forma de emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 miera de diámetro.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende un 4 - 5 % en peso de escualeno, y (b) un 1 % de un agente emulsionante que comprende polioxietilensorbitán monooleato y trioleato de sorbitán, en el que el escualeno y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 miera de diámetro.

21. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 14 - 16, o una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 17-2 para su uso en un método para inducir una respuesta inmune contra £. coli, en el que el método comprende la administración de dicha vacuna o composición inmunogénica a un sujeto.