Impresión digital espectroscópica de materias primas.

Un método para la selección de lotes de componentes de medios de cultivo para usarlos en el cultivo de una célula de mamífero que expresa una proteína de interés en el que se utilizan al menos dos componentes diferentes en el cultivo,

que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar espectros de diferentes lotes de un primer componente obtenido con un primer método espectroscópico seleccionado de entre espectroscopia NIR y espectroscopia MIR y espectros de un segundo componente obtenido con espectroscopia de fluorescencia 2D como un segundo método de espectroscopia y el rendimiento de sobrenadante de cultivo de la proteína de interés obtenida en un cultivo usando combinaciones de estos lotes diferentes del primer y el segundo componente,

b) identificar una relación de espectros fusionados de las dos técnicas espectroscópicas diferentes tras computar resultados de espectros PCA con el rendimiento del cultivo,

c) proporcionar un espectro de un lote adicional del primer componente obtenido con el primer método espectroscópico y un espectro de un lote adicional del segundo componente obtenido con el segundo método espectroscópico,

d) seleccionar la combinación del primer componente proporcionado y el segundo componente proporcionado si el rendimiento de sobrenadante predicho del cultivo basado en la relación de espectros fusionados tras computar resultados de espectros PCA identificados en b) se halla dentro de +/- 10 % del resultado del producto proporcionado en a).

Impresión digital espectroscópica de materias primas

El presente documento describe un método para la evaluación de componentes de material de cultivo con respecto al rendimiento del producto a la recepción del mismo y antes de y sin la necesidad de efectuar un cultivo de prueba.

Antecedentes de la invención

El mercado de los productos biofarmacéuticos recombinantes ha aumentado de manera constante desde principios de los ochenta, cuando la tecnología de ADN recombinante hizo posible expresar proteínas recombinantes en diferentes tipos de microorganismos como bacterias, levadura o células de mamífero. Desde entonces, estos productos de proteínas se han utilizado en un amplio intervalo de aplicaciones farmacéuticas y de diagnóstico.

A medida que aumenta la demanda de proteínas recombinantes, la necesidad de unos procesos de producción altamente eficaces y robustos es inminente. Uno de los factores más importantes e influyentes en la necesidad de unos procesos de producción robustos y reproducibles es la composición de los materiales de partida, como los medios de cultivo. La mayoría de medios de cultivo son mezclas complejas de, entre otras cosas, sales inorgánicas, azúcares, aminoácidos, vitaminas, ácidos orgánicos y tampones. En muchos casos, las materias primas complejas, no definidas de forma química, como los hidrolizados de proteína de origen vegetal o bacteriano se utilizan para promover el crecimiento de células y la producción de proteínas.

Habitualmente, las materias primas se suministran como mezclas en polvo y después se disuelven en agua para formar el medio de cultivo. En muchos casos se puede observar una variabilidad significativa de unos lotes a otros en hidrolizados de proteína no definidos químicamente y también en mezclas de medios básales químicamente definidos, conduciendo a grandes variaciones en el rendimiento de proteínas terapéuticas producidas de forma recombinante.

Las técnicas de impresión digital espectroscópica rápida, como las espectroscopias de infrarrojo cercano, de infrarrojo medio, de Raman o de fluorescencia bidimensional, son relativamente baratas y resultan muy adecuadas para analizar mezclas complejas. Estos métodos generan cantidades muy grandes de datos altamente dimensionales que solo se pueden manejar por métodos quimiométricos como el análisis de componentes principales (PCA) o el modelado por mínimos cuadrados parciales (PLS). La combinación de métodos espectroscópicos complejos y quimiométrica se utiliza de manera habitual en las pruebas de identidad de materias primas o como herramienta para la clasificación de materias primas.

La utilización del análisis de componentes principales (PCA) y mínimos cuadrados parciales (PLS) para el procesamiento y modelado de datos complejos ha sido analizada por Naes, T., et al., (Naes, T., et al., NIR Publications, (22)). En el documento WO 29/8683 se describe un método para la organización jerárquica de datos utilizando PLS. En el documento WO 28/14659 se describe un analizador y un método para determinar la importancia relativa de fracciones de mezclas biológicas. En el documento WO 29/61326 se describe la evaluación de materiales cromatográficos.

En el documento US29/36932 se describe un método rápido de clasificación para conjuntos de datos multivariados. El análisis de datos espectrales para la selección de un modelo de calibración se describe en el documento EP 2 128 599. En el documento US 5.498.875 se describe un procesamiento de señales para el análisis químico de muestras. Un método para clasificar materiales científicos como los materiales de silicato, materiales poliméricos y/o nanomateriales se describe en el documento US28/177481. En el documento US21/129857 se describen métodos para el aislamiento y la identificación de microorganismos.

Sumario de la invención

Se ha hallado que el rendimiento de los procesos de producción de proteínas recombinantes se pueden predecir basándose en la combinación de espectros NIR y de fluorescencia 2D de componentes de medios, como hidrolizados de proteína y/o preparaciones de medios definidos químicamente los cuales se utilizan como componentes de un medio de cultivo complejo.

Un aspecto, tal como aquí se señala, es un método para la selección de lotes de componentes de medios de cultivo para utilizarlos en el cultivo de una célula de mamífero que exprese una proteína de interés en la que se utilicen al menos dos componentes diferentes en el cultivo, empleando para dicha selección datos espectrales fusionados de dos técnicas espectroscópicas distintas.

El método de acuerdo con la presente invención para la selección de lotes de componentes de medios de cultivo que se van a utilizar en el cultivo de una célula de mamífero que exprese una proteína de interés en la que se utilicen al menos dos componentes diferentes en el cultivo comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar espectros de distintos lotes de un primer componente obtenido con un primer método espectroscópico seleccionado a partir de espectroscopia NIR y espectroscopia MIR, y espectros de un segundo componente obtenido mediante espectroscopia de fluorescencia 2D como un segundo método espectroscópico y el rendimiento de sobrenadante de cultivo de la proteína de interés obtenido en un cultivo utilizando combinaciones de estos lotes diferentes del primer y el segundo componente,

b) identificar una relación de espectros fusionados de las dos técnicas espectroscópicas diferentes tras computar los resultados del análisis PCA de espectros con el rendimiento del cultivo,

c) proporcionar un espectro de un lote adicional del primer componente obtenido con el primer método espectroscópico y lote un espectro de un lote adicional del segundo componente obtenido con el segundo método espectroscópico, y

d) seleccionar la combinación del primer componente proporcionado y el segundo componente proporcionado si el rendimiento de sobrenadante predicho para el cultivo basado en la relación de espectros fusionados tras contabilizar los resultados de los espectros PCA identificados en b) se halla dentro del 1 % más o menos del rendimiento medio proporcionado en a).

En una realización preferente el procesamiento de los espectros comprende la eliminación de las regiones de absorción de agua y la aplicación de una corrección multiplicativa de la dispersión, y/o el filtrado comprende un filtrado Savltzky-Golay.

En una realización preferente los patrones identificativos del espectro se hallan por análisis de componentes principales. En una realización preferente el análisis de componentes principales es un análisis de componentes principales desdoblado. En una realización preferente el desdoblamiento preserva la Información del primer modo (muestra). En una realización preferente el allsamlento Savitzky- Golay se hace con una ventana de 19 puntos y un polinomio de segundo grado. En una realización preferente los datos son un promedio, y el número óptimo de componentes principales se elige utilizando el método de validación cruzada dejando uno fuera.

En una realización preferente el procesamiento comprende la exclusión de las regiones de dispersión y la interpolación de los puntos eliminados. En una realización preferente los espectros finales se componen de un intervalo de longitud de onda de emisión de 29 nm a 594 nm y un intervalo de longitud de onda de excitación de

23 nm a 575 nm.

En una realización preferente la identificación de una relación entre espectros fusionados y comprimidos con resultados del PCA, con un rendimiento del cultivo al momento de su cosecha se efectúa mediante análisis de mínimos cuadrados parciales.

En una realización preferente los espectros NIR se recopilan de la región del número de onda de 4.784 cm'1 a 8.936 cm'1.

En una realización preferente la dimensionalidad espectral se reduce de 1.39 números de onda a 3 componentes principales.

En una realización preferente la proteína de interés es un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o un conjugado de anticuerpo.

Descripción detallada de realizaciones preferentes de la invención

Se ha hallado que el rendimiento de los procesos de producción de proteínas recombinantes se puede predecir basándose en la información combinada contenida en espectros NIR y de fluorescencia 2D de componentes de medios, como hidrolizados de proteína y/o preparaciones de medios químicamente definidas que se utilicen como componentes de un medio de cultivo complejo.

El presente documento describe un método en el que se combinan espectros de dos técnicas distintas de espectroscopia (ortogonales)- tras procesarlos para convertirlos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la selección de lotes de componentes de medios de cultivo para usarlos en el cultivo de una célula de mamífero que expresa una proteína de interés en el que se utilizan al menos dos componentes diferentes en el cultivo, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar espectros de diferentes lotes de un primer componente obtenido con un primer método espectroscóplco seleccionado de entre espectroscopia NIR y espectroscopia MIR y espectros de un segundo componente obtenido con espectroscopia de fluorescencia 2D como un segundo método de espectroscopia y el rendimiento de sobrenadante de cultivo de la proteína de interés obtenida en un cultivo usando combinaciones de estos lotes diferentes del primer y el segundo componente,

b) identificar una relación de espectros fusionados de las dos técnicas espectroscópicas diferentes tras computar resultados de espectros PCA con el rendimiento del cultivo,

c) proporcionar un espectro de un lote adicional del primer componente obtenido con el primer método espectroscópico y un espectro de un lote adicional del segundo componente obtenido con el segundo método espectroscópico,

d) seleccionar la combinación del primer componente proporcionado y el segundo componente proporcionado si el rendimiento de sobrenadante predicho del cultivo basado en la relación de espectros fusionados tras computar resultados de espectros PCA identificados en b) se halla dentro de +/- 1% del resultado del producto proporcionado en a).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la identificación se hace mediante análisis de componentes principales.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que el análisis de componentes principales es un análisis de componentes principales desdoblado.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el desdoblamiento preserva la información del primer modo (muestra).

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, caracterizado por que la identificación es de una relación entre espectros fusionados y comprimidos con los resultados PCA con un rendimiento de cultivo en el momento de la cosecha mediante análisis de mínimos cuadrados parciales.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, caracterizado por que la proteína de interés es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un conjugado de anticuerpo.