Identificación y uso de genes diana para el control de nematodos parásitos de plantas.

Un polinucleótido que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos,

en el que la primera secuencia de polinucleótidos está seleccionada de:

(a) un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1920, en el que la captación por un nematodo parásito de las plantas de una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que comprende al menos una hebra que es complementaria a dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicho nematodo y

(b) un complemento de la secuencia de (a), en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en el que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar una molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada,

en el que el polinucleótido está operativamente ligado a un vector heterólogo

Identificación y uso de genes diana para el control de nematodos parásitos de plantas Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al control genético de enfermedades de las plantas producidas por nematodos parásitos de las plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación de secuencias codificantes diana y al uso de tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de secuencias codificantes diana en las células de un nematodo parásito de las plantas para proporcionar un efecto protector de la planta.

2. Descripción de la técnica relacionada Las plantas están sometidos a múltiples potenciales agentes causantes de enfermedad, que incluyen nematodos parásitos de las plantas, que son organismos activos flexibles alargados que viven en superficies húmedas o en entornos líquidos, que incluyen películas de agua dentro de la tierra y tejidos húmedos dentro de otros organismos. Hay numerosas especies de nematodos parásitos de las plantas, que incluyen diversos nematodos quísticos (por ejemplo, Heterodera sp.) , nematodos del nudo de la raíz (por ejemplo, Meloidogyne sp.) , nematodos de la lesión (por ejemplo, Pratylenchus sp.) , nematodos daga (por ejemplo, Xiphinema sp.) y nematodos del tallo y los bulbos (por ejemplo, Ditylenchus sp.) , entre otros. Los nematodos tilénquidos (miembros del orden Tylenchida) , que incluyen las familias Heteroderidae, Meloidogynidae y Pratylenchidae, son el grupo más grande y más económicamente importante de los nematodos parásitos de las plantas. Otros nematodos parásitos de las plantas importantes incluyen nematodos dorilaimidos (por ejemplo, Xiphinema sp.) , entre otros. Las especies de nematodos crecen mediante una serie de etapas del ciclo vital y mudas. Normalmente, hay cinco etapas y cuatro mudas: etapa de huevo; J1 (es decir, primera etapa juvenil) ; M1 (es decir, primera muda) ; J2 (segunda etapa juvenil; algunas veces eclosión del huevo) ; M2; J3; M3; J4; M4; A (adulto) . Las etapas juveniles (“J”) también se denominan algunas veces estadios larvales (“L”) . La expresión génica puede ser específica para una o más etapas del ciclo vital.

Algunas especies de nematodos han evolucionado como parásitos de gran éxito tanto en las plantas como en los animales y son responsables de pérdidas económicas significativas en la agricultura y ganado y de morbilidad y mortalidad en seres humanos. Los parásitos nematodos de las plantas pueden habitar en todas las partes de las plantas, que incluyen raíces, capullos de flores en desarrollo, hojas y tallos. Los parásitos de las plantas se clasifican basándose de sus hábitos alimenticios en las amplias categorías ectoparásitos migratorios, endoparásitos migratorios y endoparásitos sedentarios. Los endoparásitos sedentarios, que incluyen los nematodos del nudo de la raíz (Meloidogyne) y nematodos quísticos (Globodera y Heterodera) , inducen sitios de alimentación (“sincitios”) y establecen infecciones a largo plazo dentro de las raíces que son frecuentemente muy dañinas para los cultivos. Se estima que los nematodos parásitos le cuestan a las industrias hortícolas y agrícolas más de 78 billones de dólares en el mundo al año, basándose en un promedio estimado del 12 % de pérdida anual, propagados a todos los cultivos principales. Por ejemplo, se estima que los nematodos producen pérdidas de soja de aproximadamente 3, 2 billones de dólares anualmente en el mundo (Barker y col., 1994) .

Se han proporcionado composiciones, procedimientos y agentes para controlar infestaciones por nematodos de varias formas. Se han intentado procedimientos de control biológico y cultural, que incluyen cuarentenas de plantas, en numerosos casos. En algunos cultivos se han identificado genes de resistencia de las plantas que permiten resistencia o tolerancia a nematodos. Normalmente se han aplicado composiciones químicas tales como nematicidas a la tierra en la que están presentes los nematodos parásitos de las plantas. Sin embargo, hay una necesidad urgente de controles de nematodos seguros y eficaces. Factores referentes a las desventajas de las actuales estrategias de control incluyen importancia fundamental de la sostenibilidad de la agricultura, y nuevas reglamentaciones gubernamentales que puedan prevenir o limitar duramente el uso de muchos agentes antihelmínticos agroquímicos disponibles.

Los agentes químicos son frecuentemente no selectivos, y ejercen sus efectos sobre organismos no diana, alterando eficazmente poblaciones de microorganismos beneficiosos, durante un periodo de tiempo tras la aplicación del agente. Los agentes químicos pueden persistir en el entorno y solo metabolizarse lentamente. Los fumigantes de tierra nematicidas tales como cloropicrina y bromuro de metilo y compuestos relacionados son altamente tóxicos, y el bromuro de metilo se ha identificado como compuesto destructor de ozono. Así, su registro para su uso en los Estados Unidos no se ha renovado. Estos agentes también pueden acumularse en la capa freática o la cadena alimentaria, y en especies de nivel trófico superior. Estos agentes también pueden actuar de mutágenos y/o carcinógenos para producir modificaciones genéticas irreversibles y perjudiciales. Así, cada vez se están estudiando más procedimientos alternativos para el control de nematodos, tales como procedimientos genéticos.

El organismo Caenorhabditis elegans, un nematodo bacterívoro, es el modelo genético de nematodo más ampliamente estudiado. Bases de datos públicas y privadas contienen una abundancia de información sobre su genética y desarrollo, pero el aplicar prácticamente esta información para el control de nematodos parásitos de las plantas sigue siendo un reto (McCarter y col., 2003; McCarter 2004) . Previamente ha sido poco práctico identificar

rutinariamente un gran número de genes diana en nematodos distintos de C. elegans, tales como nematodos parásitos de las plantas, para el posterior análisis funcional, por ejemplo, por análisis de iARN. Por tanto, ha existido una necesidad de procedimientos mejorados de identificación de genes diana, cuya supresión de la expresión conduzca a controlar la infestación por nematodos.

Muchos genes en C. elegans tienen ortólogos en animales metazoarios que incluyen insectos y vertebrados, además de otros nematodos. En los últimos años se ha generado una colección de marcadores de secuencia expresada (EST) enormemente expandidas de más de 30 especies de nematodos parásitos de las plantas y animales (Parkinson y col., 2004) . A partir de 2005 había aproximadamente 560.874 secuencias de nucleótidos en Genbank de nematodos distintos de especies de Caenorhabditis y están en proceso proyectos públicos para generar secuencias borrador de Meloidogyne hapla (nematodo del nudo de la raíz) , Haemonchus contortus (parásito de ovejas) , Trichinella spiralis (parásito de seres humanos y otros mamíferos) (430.000 trazas de secuencias enviadas) y Pristionchus pacificus (nematodo vivo libre) (149.000 trazas de secuencias enviadas) . Los 20.109 EST están disponibles de Heterodera glycines que representan porciones de aproximadamente 9.000 genes (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 11/360.355 presentada el 23 de febrero de 2006) . Se espera que genes conservados retengan frecuentemente las mismas funciones o funciones muy similares en diferentes nematodos. Esta equivalencia funcional se ha demostrado en algunos casos transformando C. elegans con genes homólogos de otros nematodos (Kwa y col., 1995; Redmond y col., 2001) . Tal equivalencia se ha mostrado en comparaciones de filos cruzados para genes conservados y se espera que sea más robusta entre especies dentro de un filo.

La interferencia por ARN (iARN) es un procedimiento que utiliza rutas celulares endógenas, por lo que un gen diana específico para ARN bicatenario (ARNbc) produce la degradación del ARNm de interés. En los últimos años, la iARN se ha usado para realizar la “inactivación” de genes en varias especies y sistemas experimentales, del nematodo C. elegans, a plantas, a embriones de insecto y células en cultivo de tejido (Fire y col., 1998; Martinez y col., 2002; McManus y Sharp, 2002) . La iARN funciona mediante una ruta endógena que incluye el complejo de la proteína Dicer que genera ARN interferente pequeño (ARNip) de ∼21 nucleótidos a partir del ARNbc original y el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que usa guías de ARNip para reconocer y degradar los ARNm correspondientes. Solo transcritos complementarios al ARNip se escinden y degradan, y así la inactivación de la expresión del ARNm es normalmente... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos, en el que la primera secuencia de polinucleótidos está seleccionada de:

(a) un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº : 1920, en el que la captación por un nematodo parásito de las plantas de una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que comprende al menos una hebra que es complementaria a dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicho nematodo y

(b) un complemento de la secuencia de (a) , en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en el que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar una molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada,

en el que el polinucleótido está operativamente ligado a un vector heterólogo.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, está definido como que comprende un vector de transformación de plantas.

3. Una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria obtenible por la expresión de un polinucleótido según la reivindicación 1, en la que la captación de dicha secuencia de ribonucleótidos por un nematodo parásito de las plantas inhibe el crecimiento de dicho nematodo.

4. La secuencia de ribonucleótidos bicatenaria de la reivindicación 3,

(i) que es obtenible transcribiendo una secuencia de polinucleótidos recombinante que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1, en un ácido ribonucleico para formar la molécula de ribonucleótido bicatenario; o

(ii) en la que la captación de la secuencia de polinucleótidos por el nematodo parásito de las plantas inhibe la expresión de una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a dichas secuencias de polinucleótidos.

5. Un vector de transformación de plantas que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1.

6. Una célula o una planta que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

7. La célula de la reivindicación 6, definida como

(i) célula procariota; o

(ii) una célula eucariota a condición de que dicha célula eucariota no sea una célula madre embrionaria humana y/o célula germinal; o

(iii) una célula vegetal.

8. Una semilla de la planta de la reivindicación 6, en la que la semilla comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

9. La planta de la reivindicación 6, en la que dicho polinucleótido se expresa en la célula vegetal como una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria, preferentemente

(i) el nematodo parásito de las plantas es Heterodera glycines; o

(ii) la captación de la cantidad inhibidora del nematodo parásito de las plantas de la secuencia de ribonucleótidos bicatenaria inhibe el crecimiento del nematodo.

10. Un procedimiento de control de una población de nematodos parásitos de las plantas que comprende proporcionar un agente que comprende una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que funciona tras ser captada por el nematodo para inhibir una función biológica dentro de dicho nematodo, en el que

(i) el agente comprende un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 1920 o complementos de la misma; o

(ii) dichas secuencias de polinucleótidos presentan de aproximadamente el 95 a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencias de nucleótidos a lo largo de al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de dicho nematodo y se hibrida con una segunda secuencia de polinucleótidos que es complementaria a dicha primera secuencia de polinucleótidos, y en el que dicha secuencia codificante derivada de dicho nematodo es SEC ID Nº : 1920 o complementos de la misma.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho nematodo es Heterodera glycines.

12. Un procedimiento de controla de una población de nematodos parásitos de las plantas que comprende proporcionar en la planta huésped de un nematodo parásito de las plantas una célula vegetal transformada que expresa una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por el nematodo parásito de las plantas para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce la disminución del crecimiento del nematodo o población de nematodos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que

(i) el nematodo presenta disminución del crecimiento tras la infección de la planta huésped; o

(ii) dicho nematodo está seleccionado del grupo que consiste en Heterodera sp., Meloidogyne sp., Globodera sp., Helicotylenchus sp., Ditylenchus sp., Pratylenchus sp., Paratylenchus sp., Rotylenchus sp., Tylenchulus sp., Tylenchorhynchus sp., Hoplolaimus sp., Belonolaimus sp., Anguina sp., Subanguina sp. y Nacobbus sp., preferentemente el nematodo es Heterodera glycines.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el polinucleótido funciona tras ser captado por el nematodo parásito de las plantas para suprimir un gen que realiza una función esencial para la supervivencia o crecimiento de nematodos, siendo dicha función la replicación de ADN.

15. Un procedimiento de reducción del número de sitios de alimentación de Heterodera establecidos en el tejido de raíz de una planta huésped, que comprende proporcionar en la planta huésped de una Heterodera sp. una célula vegetal transformada que expresa una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por Heterodera sp. para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce una disminución en el número de sitios de alimentación establecidos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.

16. Un procedimiento de control de la infestación por la plaga de nematodos de planta en una planta que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de nematodos de planta un ARNbc que comprende:

a) una secuencia de nucleótidos sentido; y b) una secuencia de nucleótidos antisentido complementaria a dicha secuencia de nucleótidos sentido, en el que dicha secuencia de nucleótidos sentido comprende la primera secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha dieta comprende una célula de planta transformada para expresar dicha secuencia de nucleótidos sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido.

18. Un procedimiento de mejora del rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infección por nematodos parásitos de las plantas, o de mejora de la tolerancia a la sequía de una planta de cultivo sometida a infección por nematodos parásitos de las plantas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) introducir un polinucleótido según la reivindicación 1 en dicha planta de cultivo; b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido; en el que la expresión del polinucleótido inhibe la infección por nematodos parásitos de las plantas o crecimiento y pérdida de rendimiento debido a infección por nematodos parásitos de las plantas, o mejora la tolerancia a la sequía de la planta de cultivo.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la planta de cultivo es soja (Glycine max) .

20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la expresión del polinucleótido produce una molécula de ARN que suprime al menos un primer gen diana en un nematodo parásito de las plantas que se ha puesto en contacto con una porción de dicha planta de cultivo, en el que el gen diana realiza una función esencial en la replicación de ADN.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el nematodo parásito de las plantas es un nematodo tilénquido, preferentemente el nematodo parásito de las plantas es Heterodera sp., lo más preferentemente el nematodo parásito de las plantas es Heterodera glycines.

22. Un procedimiento de producción de alimento o pienso que comprende obtener una planta según la reivindicación 6 o una parte de la misma, y preparar alimento o pienso de la planta o parte de la misma.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el alimento o pienso se define como aceite, comida, proteína, almidón, harina o forraje.

24. Un procedimiento de modulación de la expresión de un gen diana en una célula de nematodo parásito de las plantas, comprendiendo el procedimiento:

(a) transformar una célula de planta con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARNbc de SEC ID Nº : 1920, operativamente ligado a un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, en el que dicho ARNbc inhibe la función del polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº : 1920;

(b) cultivar la célula de planta transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo de células de planta que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas;

(c) seleccionar células vegetales transformadas que han integrado la secuencia de ácidos nucleicos en sus genomas;

(d) cribar las células vegetales transformadas para la expresión del ARNbc codificado por la secuencia de 10 ácidos nucleicos; y

(e) seleccionar una célula de planta que expresa el ARNbc.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, que comprende además regenerar una planta a partir de la célula de planta que expresa el ARNbc; por lo que la expresión del gen en la planta es suficiente para modular la expresión de un gen diana en una célula de nematodo parásito de las plantas que pone en contacto la planta o célula de planta transformada.

Locus Descripción Inicio de huevo de N2 Inicio de L4 de N2 Resultado

control actina adultos móviles, estériles P0-WT, poca progenie control positivo

control GFP WT, >200 progenie WT, >200 progenie WT, >200 progenie WT, >200 progenie control negativo

R03E1.2 Y57E12AL.a VACI WT, 20e WT, 75e P0-WT, poca progenie P0-WT, camada red. Fenotipo, no P0 letal Fenotipo, no P0 letal

C34G6.6 PANI muertos, 0e adultos móviles, LVL P0 letal de inicio de huevo

F52B11.3 PAN2 muertos, 0e adultos móviles, LVL P0 letal de inicio de huevo

F54D11.1 MT P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA Fenotipo, no P0 letal

T25C8.2 act-5 P0 muy enfermos, estériles P0 enfermos, estériles o algunos F1 todos LVA muertos, 0e P0-WT, LVL-LVA P0 enfermo, estéril o algunos F1 todos LVA P0 WT, F1 LVL/LVA P0 letal de inicio de huevo

Y57G11C.15 Proteína de transporte Sec61 muy enfermos, estériles muy enfermos, estériles, muertos adultos móviles, estériles RUP, muertos P0 letal de inicio de huevo y L4

C47E12.5 uba-1 muertos, 0e muertos, 0e P0-WT, LVL P0 WT, F1 LVL P0 letal de inicio de huevo

Y41E3.1** WT WT reducción del 30 % de la camada WT WT WT Todavía sin efecto

Y57E12AL.6 Bag-o-worms+larvas P0 camada red., F1 enfermos LVA adultos móviles, Fl LVA adultos móviles, Fl LVA En progreso

C32E12.4 adultos móviles, estériles WT WT WT En progreso

Y48B6A.1* WT WT WT WT WT WT Todavía sin efecto

Y48B6A.1* En progreso

R07E4.6* kin-2 Muy DPY, enfermos, estériles Muy DPY, estériles, muertos Muy DPY, estériles, muertos P0 DPY. camada red, F1 25% de DPY P0 DPY, camada red, F1 75% de DPY P0 DPY, camada red, F1 90% de DPY P0 letal / DPY de inicio de huevo y L4

K11D9.2a sca-1 P0 WT, cámara red. – F1 LVA P0 estériles, crecimiento, enfermos P0 DPY, camada red., F1 LVA P0 móviles, huevos red., F1 LVA P0 enfermo de inicio de huevo?

ZK20.3** WT WT WT WT Todavía sin efecto

K07B1.7** WT WT WT WT Todavía sin efecto

C38D4.6 P0WT.F1 LVL P0 WT, F1 LVL Fenotipo, no P0 letal

T02E1.5** dhs-3 WT WT WT WT Todavía sin efecto

F17E9.5*** WT WT En progreso

C25D7.2*** WT WT En progreso

K06B4.1 WT WT En progreso

F08B1.1a reducción del 85 % de la camada WT Fenotipo, no P0 letal

C34F11.6 WT WT En progreso

T14G10.5 En progreso

F28D9.8 por hacer por hacer En progreso

W09G12.7 En progreso

C37C3.2 por hacer por hacer En progreso

FIG. 2