Identificación, optimización y uso de epítopos compartidos de HLA-B*0702 para inmunoterapia.

Método para identificar un péptido restringido por HLA-B*0702 que puede desencadenar una respuesta citotóxica contra al menos dos antígenos de la familia multigénica MAGE-A,

que comprende al menos las siguientes etapas:

(i) identificar, en los genes de dicha familia multigénica, péptidos de 9 o 10 aminoácidos que tienen una P en la posición 2 y 5 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, K, H y M en la posición 3;

(ii) alinear las secuencias obtenidas en (i);

(iii) identificar, entre los péptidos obtenidos en la etapa (i), un grupo de al menos dos péptidos, en los que al menos un péptido es un "péptido esencialmente compartido", es decir, es de tal manera que su región antigénica difiere de las de otros péptidos del grupo en, como máximo, un residuo, en donde dicha región antigénica se extiende desde la posición 4 a la posición 8 en un péptido que tiene 9 aminoácidos, y desde la posición 4 a la posición 9 en un péptido que tiene 10 aminoácidos;

(iv) medir la inmunogenicidad del péptido esencialmente compartido; y

(v) modificar la secuencia del péptido esencialmente compartido para aumentar su inmunogenicidad; en donde el péptido obtenido en la etapa (v) provoca una respuesta citotóxica contra al menos dos antígenos de dicha familia multigénica.

Identificación, optimización y uso de epítopos compartidos de HLA-B*72 para inmunoterapia

La presente invención hace referencia al área de la inmunoterapia con péptidos. En particular, la invención proporciona nuevos métodos y materiales para tratar de manera eficaz a pacientes que tienen un fenotipo HLA- B*72, basado en péptidos que representan epítopos compartidos de antígenos tumorales.

La inmunización o inmunoterapia con péptidos es una aproximación terapéutica que actualmente suscita un gran interés en el contexto de la prevención o tratamiento del cáncer. El principio del mismo está basado en la inmunización con péptidos que reproducen los epítopos T de los antígenos tumorales que son reconocidos por Linfocitos T citotóxicos (CTLs), los que cumplen una función en la eliminación de las células cancerígenas que expresan estos antígenos en su superficie.

Debe recordarse que los CTL no reconocen los antígenos de la proteína completa, sino fragmentos de péptidos de la misma, presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresadas en la superficie de diversas células. Estos fragmentos de péptidos constituyen los epítopos T. Los péptidos presentados por el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) tienen generalmente de 8 a 11 aminoácidos, y son reconocidos por linfocitos T CD8+, que representan el componente principal de la respuesta citotóxica. Durante el procesamiento del antígeno, tiene lugar una selección de péptidos, que da como resultado una jerarquía de presentación de péptidos. Los péptidos que son preferentemente presentados por las moléculas del MHC I se denominan inmunodominantes mientras que los péptidos que son presentados débilmente se denominan crípticos. Los péptidos inmunodominantes muestran una elevada afinidad por el MHC I y son inmunogénicos, mientras que los péptidos crípticos muestran una baja afinidad por MHC I y son no inmunogénicos.

La identificación de epítopos específicos a tumores, y en particular (dado el papel esencial de la respuesta del CD8+ en citotoxicidad) de aquellos presentados por los alelos del MHC I más frecuentes, constituye un paso esencial para el desarrollo de composiciones de inmunoterapia anti-tumoral. Muchos antígenos tumorales se conocen en la actualidad; algunos de los epítopos T de estos antígenos han sido identificados, y la eficacia de las vacunas basadas en péptidos que reproducen estos epítopos T se ha demostrado en muchos casos (Menez-Jamet y Kosmatopoulos, 29).

Sin embargo, la expresión de la mayoría de los antígenos tumorales está restringida a ciertos tipos de tumores histológicos que limita su uso clínico. La búsqueda de antígenos tumorales universales expresados ampliamente ha sido intensificada con la identificación de antígenos con funciones esenciales para el mantenimiento del fenotipo oncogénico, y se está haciendo un esfuerzo para identificar epítopos expresados por una mayoría de pacientes.

Otra limitación considerable de la inmunoterapia péptido viene de la apariencia, en ciertos pacientes, de variantes tumorales (variantes de escape) que ya no expresan más el antígeno reconocido por los linfocitos T citotóxicos.

Algunos antígenos tumorales pertenecen a familias multigénicas: dentro de la misma familia, existe una homología de secuencias que pueden dar como resultado la existencia de epítopos compartidos comunes a dos o más miembros de la misma familia.

En general, diversos miembros de la misma familia de antígenos se expresan en diversos tipos de tumores; el uso de un epítopo compartido por estos antígenos podrían hacer posible obtener vacunas antitumorales con un amplio

espectro de actividad.

Además, en muchos casos, diversos antígenos de la misma familia son co-expresados en la misma línea tumoral; ya que la probabilidad de pérdida de la expresión de todos estos antígenos es extremadamente baja, el uso de un epítopo compartido por estos antígenos puede evitar la aparición de variantes de escape.

Entre los antígenos tumorales que se sabe pertenecen a una familia multigénica, se hará particular mención de los antígenos de las familias MAGE-A, HER, BAGE o GAGE.

MAGE-A es una familia multigénica que consiste en 12 genes homólogos (MAGE-A1 a A12) localizados en la región q28 del cromosoma X (De Plaen et al., 1994). Entre los miembros de esta familia, MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, - A1 y -A12 son fuertemente expresados por tumores pero no por tejidos normales, con la excepción de los testículos y de la placenta.

Los antígenos MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A1 y -A12 están presentes en un amplio espectro de tumores de muy variado origen histológico, tales como melanomas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, tumores de cabeza y cuello, y sarcomas, mielomas, etc.

Las vacunas para el cáncer basadas en MAGE, tales como el tratamiento agente ¡nmunoterapéutlco antltumoral antígeno-específico (ASCI, por sus siglas en inglés) MAGE-A3 (GlaxoSmithKIine), se encuentran actualmente en fase tardía de desarrollo con resultados alentadores. Por ejemplo, esta vacuna, que está basada en antígenos tumorales presentados al sistema inmunológico del paciente como proteínas recombinantes en combinación con un sistema adyuvante propietario de GSK, ha completado con éxito dos ensayos clínicos en melanoma y cáncer de pulmón no microcítico.

La expresión de cada antígeno MAGE-A puede variar de un tumor a otro, pero en general, la gran mayoría de tumores expresa al menos un antígeno MAGE-A.

A pesar de la ventaja potencial de utilizar epítopos T compartidos, esta aproximación sólo ha sido utilizada en contadas ocasiones debido a la poca frecuencia de regiones de tamaño apropiado (al menos 8 aminoácidos para un péptido presentado por la MHC I) que son completamente idénticas de un antígeno a otro.

Tanzarella et al. (1999) describió la identificación de un epítopo restringido por HLA-B*371 compartido por cuatro miembros diferentes de la familia MAGE (MAGE-1, -2, -3, and -6). Los CTL específicos para un péptido que comprende este epítopo (codificado por codones 127-136 del gen MAGE-1) pudieron reconocer de forma específica las células Cos-7 cotransfectados con HLA-B*371 y cualquiera de estos genes MAGE.

La WO 1/42267 revela epítopos de MAGE2/3, y vacunas basadas en epítopos dirigidas a tumores que portan el MAGE2/3.

Los inventores han descrito previamente un método para la identificación de epítopos de péptidos presentados por una molécula de HLA clase I y compartidos por diversos antígenos de la misma familia multigénica. Este método está caracterizado por las siguientes etapas (EP1 485 719):

a) alinear las secuencias de dichos antígenos para identificar en cada uno de ellos una secuencia de 8 a 1 aminoácidos que comprenden al menos una secuencia pentapeptídica común precedida por 3 aminoácidos en el extremo N-terminal y, opcionalmente, seguido de uno o dos aminoácidos en el extremo C-terminal; de hecho, los autores han observado que una identidad limitada a la secuencia de 5 aminoácidos que se extiende desde las posiciones P4 a P8 del péptido era suficiente.

b) preparar los péptidos correspondientes a las secuencias identificadas y determinar la afinidad de unión de cada uno de los péptidos para la molécula de HLA de clase I implicada, y su inmunogenicidad utilizando ratones transgénicos con CMH-I humano.

c) En caso de que un péptido seleccionado sea críptico y consecuentemente no inmunogénico, el método además comprende una etapa para aumentar su inmunogenicidad.

Utilizando este método, los inventores han descrito un péptido inmunogénico definido por la secuencia YLEYRQVPV (SEQ ID No: 1), presentada por HLA-A*21 común a los antígenos MAGE-A1, -2, -3, -4, -6, -1 y -12 de la familia MAGE-A, capaz de inducir los CTL que reconocen todos los antígenos MAGE-A, y de lisar células tumorales que expresan al menos un antígeno de la familia MAGE-A. Un estudio que describe este péptido heterocítlico MAGE-A (p248V9) y sus propiedades inmunogénicas fue publicado por Graff-Dubois et al. (Journal of Immunology, 22).

Los péptidos inmunodominantes han sido ampliamente fijados como diana por vacunas antitumorales en estudios clínicos y pre-clínicos con resultados decepcionantes (Gross et al., 24). De hecho, los antígenos tumorales son con frecuencia autoproteínas sobre-expresadas por tumores y expresadas a niveles inferiores por células y tejidos normales. El sistema inmunológico no es capaz de reaccionar contra estos autoantígenos debido al proceso de autotolerancia. La autotolerancia afecta principalmente a los péptidos inmunodominantes, explicando de ese modo la incapacidad de estos... [Seguir leyendo]

1. Método para identificar un péptido restringido por HLA-B*72 que puede desencadenar una respuesta citotóxica contra al menos dos antígenos de la familia multigénica MAGE-A, que comprende al menos las siguientes etapas:

(i) identificar, en los genes de dicha familia multigénica, péptidos de 9 o 1 aminoácidos que tienen una P en la posición 2 y un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, K, H y M en la posición 3;

(ii) alinear las secuencias obtenidas en (i);

(iii) identificar, entre los péptidos obtenidos en la etapa (i), un grupo de al menos dos péptidos, en los que al menos un péptido es un `péptido esencialmente compartido, es decir, es de tal manera que su región antigénica difiere de las de otros péptidos del grupo en, como máximo, un residuo, en donde dicha región antigénica se extiende desde la posición 4 a la posición 8 en un péptido que tiene 9 aminoácidos, y desde la posición 4 a la posición 9 en un péptido que tiene 1 aminoácidos;

(iv) medir la inmunogenicidad del péptido esencialmente compartido; y

(v) modificar la secuencia del péptido esencialmente compartido para aumentar su inmunogenicidad;

en donde el péptido obtenido en la etapa (v) provoca una respuesta citotóxica contra al menos dos antígenos de dicha familia multigénica.

2. Método según la reivindicación 1, para identificar un péptido restringido por HLA-B*72 que puede desencadenar una respuesta citotóxica contra al menos tres antígenos de dicha familia multigénica, en donde el grupo de péptidos seleccionado en la etapa (iii) comprende péptidos de al menos tres genes de dicha familia multigénica.

3. Método según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el grupo de péptidos seleccionado en la etapa (iii) comprende al menos dos péptidos que tienen diferentes regiones antigénicas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el péptido esencialmente compartido seleccionado en la etapa (iii) es un epítopo no inmunogénico con cualquier aminoácido excepto P en el N-terminal, y en donde la etapa (v) consiste en sustituir el residuo C-terminal de dicho epítopo con una leucina.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el péptido esencialmente compartido en la etapa (iii) es un epítopo no inmunogénico con un aminoácido C-terminal seleccionado del grupo que consiste en L, A, I, V, M, C y T, y en donde la etapa (v) consiste en sustituir el residuo N-terminal de dicho epítopo con alanina.

6. Péptido aislado identificado por un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho péptido aislado se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 32 a 67.

7. Polipéptido quimérico, que comprende uno, dos, tres o más epítopos restringidos por HLA-B*72 según la reivindicación 6.

8. Molécula de ácido nucleico aislado diseñada para causar la expresión de un epítopo restringido por HLA-B*72 según la reivindicación 6 o un polipéptido quimérico según la reivindicación 1.

9. Composición farmacéutica que comprende al menos, como principio activo, un epítopo restringido por HLA- B*72 según la reivindicación 6, o un polipéptido quimérico según la reivindicación 7, o un ácido nucleico según la reivindicación 8.

1. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que es una vacuna.

11. Un kit de piezas que comprende, en envases separados:

(i) un primer péptido que comprende una secuencia de un epítopo restringido por HLA-B*72 seleccionado del grupo de SEQ ID Nos: 2-31, y

(ii) un segundo péptido que comprende una secuencia que consiste en un epítopo restringido por HLA- B*72 optimizado seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 32-67.

12. Kit según la reivindicación 11, en donde dicho primer péptido es un epítopo aislado seleccionado en el grupo de SEQ ID Nos: 2-31, y dicho segundo péptido es su epítopo optimizado afín.

13. Kit según la reivindicación 11o reivindicación 12, en donde dicho primer péptido comprende una secuencia seleccionada entre GPRALAETS (SEQ ID No: 15), GPRALIETS (SEQ ID No: 16) y GPRALVETS (SEQ ID No: 17), y dicho segundo péptido comprende la secuencia GPRALVETL (SEQ ID No: 54).

14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que es un kit de vacunación, en donde dichos primer y 5 segundo péptidos o polipéptidos quiméricos se presentan en dosis de vacunación separadas.