Identificación, optimización y utilización de epítopos crípticos HLA-B7 para inmunoterapia.

Epítopo críptico restringido por HLA-B*0702, que es un péptido seleccionado del grupo que comprende APRSPLAPS (ID.

SEC. No. 2), SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3), GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4).

Identificaciïn, optimizaciïn y utilizaciïn de epïtopos crïpticos HLA-B7 para inmunoterapia La presente invenciïn se refiere al sector de la inmunoterapia de pïptidos. En particular, la presente invenciïn da a conocer nuevos procedimientos y materiales para tratar eficazmente pacientes que tienen un fenotipo HLA-B*0702.

La inmunoterapia es un enfoque terapïutico que actualmente es objeto de un gran interïs en el contexto del tratamiento del cïncer. El principio de la misma se basa en la inmunizaciïn con pïptidos que reproducen epïtopos de cïlulas T de antïgenos tumorales reconocidos por los linfocitos T citotïxicos (CTL) que juegan un papel importante en la eliminaciïn de las cïlulas tumorales.

Cabe recordar que los CTL no reconocen antïgenos proteicos enteros, sino fragmentos peptïdicos de los mismos, que comprenden en general de 8 a 11 aminoïcidos, que presentan las molïculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) expresadas en la superficie de las cïlulas. La presentaciïn de estos pïptidos es el resultado del procesamiento de antïgenos que consta de tres etapas:

-degradaciïn citosïlica del antïgeno por un complejo multienzimïtico denominado proteosoma -translocaciïn de los pïptidos derivados de esta degradaciïn en el retïculo endoplasmïtico (ER) por los transportadores TAP -asociaciïn de estos pïptidos con las molïculas del MHC I y la exportaciïn de los complejos pïptido/MHC I a la superficie celular

Los complejos pïptido/MHC I interactïan con el receptor especïfico de cïlulas T (TCR) en los CTL induciendo la estimulaciïn y la amplificaciïn de estos CTL que se vuelven capaces de atacar a las cïlulas diana que expresan el antïgeno del que se deriva el pïptido.

Durante el procesamiento de los antïgenos, se lleva a cabo una selecciïn de pïptidos, lo que da como resultado una jerarquïa de presentaciïn de pïptidos. Los pïptidos que las molïculas del MHC I presentan preferentemente son denominados inmunodominantes mientras que los pïptidos que presentan dïbilmente se denominan crïpticos. Los pïptidos inmunodominantes exhiben una elevada afinidad por el MHC I y son inmunogïnicos, mientras que los pïptidos crïpticos muestran una baja afinidad por el MHC I y son no inmunogïnicos.

Los pïptidos inmunodominantes han sido determinados ampliamente como el objetivo de vacunas contra el cïncer en estudios preclïnicos y clïnicos con resultados decepcionantes (Bowne y otros, 1999; Colella y otros, 2000; Gross y otros, 2004; Hawkins y otros, 2000; Naftzger y otros, 1996; Overwijk y otros, 1998; Vierboom y otros, 1997; Weber y otros, 1998) .

Los antïgenos tumorales frecuentemente son proteïnas propias sobreexpresadas por los tumores y expresadas a niveles mïs bajos por las cïlulas y tejidos normales. El sistema inmunolïgico es incapaz de reaccionar contra estos antïgenos propios debido al proceso de la autotolerancia. La autotolerancia concierne principalmente a los pïptidos inmunodominantes (Cibotti y otros, 1992; Gross y otros, 2004; Hernïndez y otros, 2000; Theobald y otros, 1997) explicando de este modo la incapacidad de estos pïptidos para inducir una inmunidad tumoral.

Los pïptidos crïpticos estïn mucho menos involucrados en el proceso de la autotolerancia (Anderton y otros, 2002; Boisgïrault y otros, 2000; Cibotti y otros, 1992; Friedman y otros, 2004; Gross y otros, 2004; Moudgil y otros, 1999; Overwijk y otros, 2003; Sinha y otros, 2004) y, por lo tanto, pueden inducir una inmunidad tumoral eficiente siempre que se mejore su inmunogenicidad (Disis y otros, 2002; Dyall y otros, 1998; Engelhorn y otros, 2006; Gross y otros, 2004; Grossmann y otros, 2001; Lally y otros, 2001; Moudgil y Sercarz, 1994a; Moudgil y Sercarz, 1994b; Palomba y otros, 2005) .

La estrategia habitual para potenciar la inmunogenicidad de pïptidos crïpticos, que debido a su baja afinidad por MHC I son no inmunogïnicos, comprende el aumento de su afinidad por las molïculas del MHC I a travïs de sustituciones de aminoïcidos. La afinidad de los pïptidos por las molïculas del MHC I depende principalmente de la presencia en posiciones bien definidas (posiciones de anclaje primario) de residuos llamados “residuos de anclaje primario”. Estos residuos son especïficos de alelo de MHC I. Aunque a menudo necesaria, la presencia de residuos de anclaje primarios no es suficiente para asegurar una elevada afinidad por el MHC I. Se ha demostrado que los residuos situados fuera de las posiciones de anclaje primarias (residuos de anclaje secundario) pueden ejercer un efecto favorable o desfavorable sobre la afinidad del pïptido por el MHC I. La presencia de estos residuos de anclaje secundarios hace que sea posible explicar la existencia de una gran variabilidad en la afinidad de uniïn, dentro de los pïptidos que tienen los motivos de anclaje primarios.

Las sustituciones de aminoïcidos dirigidas a la mejora de la afinidad por las molïculas del MHC I deberïan conservar la antigenicidad de estos pïptidos optimizados. Los CTL generados por pïptidos optimizados deben reaccionar de forma cruzada con los correspondientes pïptidos nativos.

Muchos equipos de investigaciïn han tenido ïxito en mejorar adicionalmente la inmunogenicidad de pïptidos ya inmunogïnicos mediante el aumento de su afinidad por HLA-A*0201 (Bakker y otros, 1997; Parkhurst y otros, 1996; Sarobe y otros, 1998; Valmori y otros, 1998) . Los presentes inventores han descrito anteriormente una estrategia general para mejorar la afinidad y la inmunogenicidad de pïptidos crïpticos restringidos por HLA-A*0201 (Scardino y otros, 2002; Tourdot y otros, 2000) .

HLA-B*0702 es una molïcula expresada frecuentemente (25% de la poblaciïn) . Por lo tanto, la identificaciïn y optimizaciïn de pïptidos crïpticos tumorales restringidos por HLA-B*0702, deben ser necesarias a efectos de desarrollar vacunas eficientes contra el cïncer para pacientes que expresan HLA-B*0702.

Hasta la fecha, se han descrito pocos pïptidos tumorales presentados por HLA-B*0702. Dos pïptidos derivados de los antïgenos CEA (CEA632) (Lu y otros 2000) y TERT (TERT1123) (Cortez-Gonzales y otros, 2006) han sido identificados; estos pïptidos mostraron una fuerte afinidad de uniïn por HLA-B*0702 y fueron inmunogïnicos tanto en HLA-B*0702 de ratones transgïnicos como en pruebas in vitro con cïlulas humanas. Estos resultados experimentales muestran que estos pïptidos son pïptidos inmunodominantes.

Dos pïptidos adicionales derivados de MAGE-A1 (MAGE-A1289) (Luiten y otros, 2000) y RU2 (un nuevo antïgeno expresado por el carcinoma de cïlulas renales) (Van den Eynde y otros, 1999) se han identificado como objetivos de CTL de HLA-B*0702 que habïan sido aislados a partir de pacientes con cïncer. Aunque no existe informaciïn acerca de la afinidad por HLA-B*0702 de estos dos pïptidos, podemos considerarlos inmunodominantes porque los CTL desarrollados en pacientes con cïncer estïn siempre dirigidos contra pïptidos inmunodominantes.

Tal como se describe a continuaciïn en la parte experimental, los presentes inventores han encontrado ahora una estrategia general para aumentar la afinidad y la inmunogenicidad de un epïtopo crïptico restringido por HLAB*0702.

La presente memoria descriptiva describe un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de un epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702, que comprende una etapa de sustituciïn de un residuo del extremo N terminal de dicho epïtopo con una alanina (A) , o de sustituciïn del residuo del extremo C terminal con una leucina (L) .

A continuaciïn, la frase "epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702" se utilizarï para designar un pïptido que tiene de 8 a 11 aminoïcidos, mïs preferentemente 9 ï 10 aminoïcidos, que muestra una baja afinidad por HLA-B*0702, es no inmunogïnico y tiene la secuencia de X1PX3X4X5X6X7XSXPX10X11 (ID. SEC. No. 58) , en la que P es prolina, X3 es R (arginina) o K (lisina) o H (histidina) o M (metionina) , X1 y X4 a X7 son independientemente cualquier aminoïcido, X8 a X10 son independientemente cualquier aminoïcido o ninguno, y el aminoïcido X11 del extremo C terminal es cualquier aminoïcido con la condiciïn de que si el aminoïcido del extremo N terminal X1 es A (alanina) entonces, X11 no es ni L (leucina) ni A, ni I (isoleucina) , ni V (valina) , y no es M, y si X1 es un aminoïcido distinto de A, entonces X11 es L o A o I o V o M.

En la presente memoria descriptiva, el tïrmino "pïptido" designa no sïlo a molïculas en las que residuos de aminoïcidos estïn unidos por enlaces peptïdicos (-CO-NH-) , sino tambiïn a pseudopïptidos sintïticos o peptidomimïticos en los que se modifica el enlace peptïdico, especialmente para hacerlos mïs resistentes a... [Seguir leyendo]

1. Epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702, que es un pïptido seleccionado del grupo que comprende APRSPLAPS (ID. SEC. No. 2) , SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3) , GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4) . 5

2. Epïtopo inmunogïnico restringido por HLA-B*0702, que es un pïptido optimizado derivado de un pïptido crïptico, segïn la reivindicaciïn 1, en el que dicho epïtopo inmunogïnico se selecciona del grupo que comprende APRSPLAPL (ID. SEC. No. 6) , APKANKEIL (ID. SEC. No. 7) , APKHSDCLA (ID. SEC. No. 8) .

3. Polipïptido quimïrico, que comprende dos, tres o mïs epïtopos crïpticos restringidos por HLA-B*0702 seleccionados del grupo que comprende APRSPLAPS (ID. SEC. No. 2) , SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3) , GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4) , DPRRLVQLL (ID. SEC. No. 1) .

4. Polipïptido quimïrico, que comprende dos, tres o mïs epïtopos inmunogïnicos restringidos por HLA-B*0702

seleccionados del grupo que comprende APRSPLAPL (ID. SEC. No. 6) , APKANKEIL (ID. SEC. No. 7) , APKHSDCLA (ID. SEC. No. 8) y APRRLVQLL (ID. SEC. No. 5) .

5. Molïcula de ïcido nucleico aislada diseïada para causar la expresiïn de un epïtopo crïptico restringido por HLA

B*0702, segïn la reivindicaciïn 1, un epïtopo inmunogïnico, segïn la reivindicaciïn 2, o un polipïptido quimïrico, 20 segïn la reivindicaciïn 3 o la reivindicaciïn 4.

6. Composiciïn farmacïutica que comprende, como mïnimo, como un principio activo, un epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702 segïn la reivindicaciïn 1, o un polipïptido epïtopo inmunogïnico, segïn la reivindicaciïn 2, o un polipïptido quimïrico, segïn la reivindicaciïn 3 o la reivindicaciïn 4, o un ïcido nucleico segïn la reivindicaciïn 5.

7. Composiciïn farmacïutica, segïn la reivindicaciïn 5, que es una vacuna.

8. Kit de partes que comprende, en formulaciones separadas, un primer pïptido que tiene la secuencia de un epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702, y un segundo pïptido que corresponde a su epïtopo inmunogïnico

restringido por HLA-B*0702 cognado, en el que dicho primer pïptido es un epïtopo crïptico, segïn la reivindicaciïn 1, y dicho segundo pïptido es un pïptido inmunogïnico, segïn la reivindicaciïn 2.

9. Kit de partes que comprende, en formulaciones separadas, un primer polipïptido quimïrico que comprende dos, tres o mïs epïtopos crïpticos restringidos por HLAB *0702, y un segundo polipïptido quimïrico que comprende los epïtopos inmunogïnicos restringidos por HLA-B*0702 cognados a los epïtopos crïpticos restringidos por HLAB*0702 comprendidos en el primer polipïptido quimïrico, en el que dicho primer polipïptido quimïrico es un polipïptido quimïrico, segïn la reivindicaciïn 3, y dicho segundo polipïptido quimïrico es un polipïptido quimïrico, segïn la reivindicaciïn 4.

10. Kit, segïn la reivindicaciïn 8 o la reivindicaciïn 9, que es un kit de vacunaciïn, en el que dichos primer y segundo pïptidos o polipïptidos quimïricos estïn en dosis de vacunaciïn separadas.

11. Kit de vacunaciïn, segïn la reivindicaciïn 10, que comprende 2 ï 3 dosis de segundo pïptido o polipïptido quimïrico, y 3, 4, 5, 6 o hasta 50 dosis de primer pïptido o polipïptido quimïrico. 45

12. Vacuna, segïn la reivindicaciïn 7, o kit de vacunaciïn, segïn la reivindicaciïn 10 o la reivindicaciïn 11, en la que cada dosis comprende de 1 a 5 mg de pïptido o de 1 a 20 mg de polipïptido quimïrico.

13. Vacuna, segïn la reivindicaciïn 7 o la reivindicaciïn 12, o kit de vacunaciïn segïn cualquiera de las 50 reivindicaciones 9 a 11 en la que las dosis de vacunaciïn se formulan para inyecciïn subcutïnea.

14. Epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702, segïn la reivindicaciïn 1, o un polipïptido epïtopo inmunogïnico segïn la reivindicaciïn 2, o un polipïptido quimïrico segïn la reivindicaciïn 3 o la reivindicaciïn 4, o un ïcido nucleico segïn la reivindicaciïn 5, para su utilizaciïn en inmunoterapia preventiva o curativa contra el cïncer.

15. Pïptido, segïn la reivindicaciïn 1, para su utilizaciïn para el mantenimiento de la respuesta inmune de CTL iniciado por su pïptido cognado optimizado, o por un polipïptido que contiene el mismo.

16. Polipïptido quimïrico, segïn la reivindicaciïn 3, para su utilizaciïn para mantener la respuesta inmune iniciada

por CTL ya sea por su polipïptido quimïrico optimizado cognado, o por pïptidos optimizados cognados a dicho epïtopos crïpticos.

17. Pïptido inmunogïnico, segïn la reivindicaciïn 2, para su utilizaciïn para iniciar una respuesta inmune de CTL

contra su epïtopo crïptico restringido por HLA-B*0702 cognado. 65

18. Polipïptido quimïrico, segïn la reivindicaciïn 4, para su utilizaciïn para iniciar una respuesta inmune de CTL contra los epïtopos crïpticos restringidos por HLA-B*0702 cognados a los epïtopos presentes en dicho polipïptido quimïrico.