Identificación de variación genética en tejidos afectados.

Un procedimiento de diagnóstico de enfermedades genéticas o anomalía genética que comprende determinar la presencia de una variación genética específica de tejido en un sujeto de prueba con respecto a una estructura genética de control seleccionada,

que comprende:

(a) obtener material genético de una célula diferenciada de un tejido seleccionado, habiéndose preparado la célula diferenciando una célula pluripotente embrionaria inducida (iPS) obtenida reprogramando una célula somática del sujeto; y

(b) probar el material genético de dicha célula diferenciada para comparar una o más estructuras genéticas de dicho material genético con una o más estructuras genéticas de control para determinar la presencia de una variación genética tal en células del tejido del sujeto.

Identificación de variación genética en tejidos afectados ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la solicitud provisional de EE.UU. n.° de serie 61/237.98 presentada el 28 de agosto de 29.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo del diagnóstico molecular. Más particularmente, se refiere al uso de células madre pluripotentes inducidas (células iPS) en la determinación y caracterización de variación genética.

2. Descripción de la técnica relacionada

La patología producida por defectos en genes humanos es normalmente altamente especifica de tejido. En enfermedades hereditarias, esto sugiere que las funciones espaclotemporales específicas de los genes implicados están alteradas debido a mutaciones de la línea germinal. Aunque se ha mostrado que los genes de enfermedad generalmente tienden a expresarse en un número limitado de tejidos, todavía no está claro en muchos casos cómo los patrones de expresión específicos de tejido o estructura genética de genes de enfermedad se correlacionan con sus manifestaciones patológicas o anormales y sigue siendo difícil determinar o caracterizar los genes anormales o la estructura genética anormal en ciertos tipos de tejidos o células.

En un aspecto más amplio, el entendimiento de la variación genética es un objetivo clave de la genética humana, que engloba susceptibilidad a enfermedad, respuesta variable a fármacos y por último tratamiento y salud pública.

El cuerpo humano está compuesto por más de 2 tipos de células presentes en una diversidad de tipos de tejido. Para identificar defectos genéticos desconocidos o determinar variación genética, necesitan aislarse y caracterizarse tipos de células específicas. Sin embargo, algunos tipos de células pueden ser difíciles de obtener de un sujeto humano in vivo, tales como las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) altamente especializadas. Kennan A y col. (Human Molecular Genetlcs, vol. 11, n.°: 5, 22) desvelan el análisis de la expresión génica diferencial en tejido de la retina. Así, sigue existiendo una necesidad de desarrollar procedimientos más convenientes para proporcionar tipos de células específicas para analizar la variación genética específica de tejido.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención vence una deficiencia importante en la materia proporcionando procedimientos de diagnóstico de variación genética específica de tejido relevante para el uso de células iPS, proporcionando, específicamente, tipos de células relevantes para enfermedad específicas que pueden ser exigentes de aislar u obtener. En una primera realización, se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de una variación genética específica de tejido en un sujeto de prueba con respecto a una estructura genética de control seleccionada, que comprende: a) obtener material genético de una célula diferenciada de un tejido seleccionado, habiéndose preparado la célula diferenciando células madre pluripotentes inducidas (iPS) obtenidas reprogramando una célula somática del sujeto de prueba; y b) probar el material genético de la célula diferenciada para comparar una o más estructuras genéticas del material genético con una o más estructuras genéticas de control para determinar la presencia de una variación genética tal en células del tejido del sujeto de prueba. En ciertas realizaciones, el tejido seleccionado puede ser retina, tejido neural o tejido de músculo cardíaco.

En ciertos aspectos, el sujeto puede tener o se sospecha que tiene una anomalía genética o enfermedad genética. La enfermedad genética puede ser una enfermedad específica de tejido con defectos genéticos difíciles de caracterizar, tales como una enfermedad de la retina. Para la caracterización de la enfermedad de la retina, tipos de células de la retina específicas, tales como una célula neural de la retina o una célula de epitelio pigmentario de la retina (RPE), podrían proporcionarse por ciertos aspectos de los presentes procedimientos, específicamente diferenciando células iPS reprogramadas de una célula somática derivada del sujeto de prueba.

El material genético de la célula diferenciada, que puede comprender nucleótidos tales como ARN o ADN, podría ponerse a prueba por diversas formas conocidas en la técnica, tales como secuenciación de nucleótidos, por ejemplo, secuenciación de ARN o ADN, o análisis de micromatrices. La estructura genética puede ser secuencia de nucleótidos primaria, estructura secundaria, estructura epigenética, estructura cromosómica y similares. En otros aspectos de la invención, la estructura genética de la célula diferenciada puede representarse por un perfil de expresión, que puede reflejar las consecuencias funcionales de las regiones de control de la transcripción dentro de secuencias de ADN, que no son evidentes de la simple secuenciación de nucleótidos sola.

Ciertos aspectos de los presentes procedimientos pueden usarse para identificar variación genética, que puede ser variación de una o más secuencias codificantes, o variación de una o más secuencias no codificantes, tales como

elementos reguladores de genes. La variación genética determinada por aquellas etapas anteriores podría ser cualesquiera tipos de mutaciones, tales como deleción, inserción, desapareamientos, translocalización, duplicación, inversión, pérdida de heterocigosidad; o polimorfismo, tal como polimorfismo de un solo nucleótido (SNP); o representarse por expresión diferencial. La variación genética también puede ser una diferencia en la abundancia de transcritos resultante de diferencias en el funcionamiento de elementos de control de la expresión en los tejidos del paciente.

Los presentes procedimientos pueden ser particularmente útiles para determinar la presencia de variación genética tal como polimorfismos en regiones no codificantes, como intrones o regiones reguladoras que incluyen, pero no se limitan a, promotores, potenciadores, silenciadores, elementos sensibles o secuencias reguladoras sobre ARN, tales como 5'- o 3'- UTR (regiones sin traducir), o cualquier elemento regulador sin caracterizar. La variación genética también puede comprender variación en ARN no codificante, tal como microARN, o variación epigenética, tal como variación en la modificación de la estructura genética, por ejemplo, metilación.

Para determinar la presencia de una variación genética tal puede usarse una estructura del gen de control seleccionada, tal como una sin la variación genética seleccionada. En un cierto aspecto, la estructura del gen de control puede estar comprendida en material genético de un tejido normal, preferencialmente un tejido normal tal puede ser de un sujeto de control tal como un hermano u otro miembro de la familia del sujeto de prueba. El sujeto de control puede no tener la variación genética, especialmente en el tipo de tejido del tejido seleccionado del sujeto de prueba. En otro aspecto, la estructura del gen de control puede estar comprendida en material genético, en el que el material genético es de una célula normal seleccionada preparada diferenciando una célula iPS obtenida reprogramando una célula somática normal de un sujeto de control, tal como un sujeto que no tiene la variación genética. Preferentemente, la célula normal seleccionada o el tejido normal pueden ser del mismo tipo de tejido que el tejido seleccionado del sujeto de prueba para la comparación de estructura genética específica de tejido. En ciertos aspectos, el sujeto de control puede ser un miembro de la familia emparentado con el sujeto de prueba.

Las realizaciones tratadas en el contexto de procedimientos y/o composiciones de la invención pueden emplearse con respecto a cualquier otro procedimiento o composición descrito en el presente documento. Así, una realización referente a un procedimiento o composición también puede aplicarse a otros procedimientos y composiciones de la invención.

Como se usa en el presente documento, los términos "codificar" o "que codifica" con referencia a un ácido nucleico se usan para hacer la invención fácilmente entendióle por el experto; sin embargo, estos términos pueden usarse indistintamente con "comprender" o "que comprende", respectivamente.

Como se usa en el presente documento, la especificación "un" o "uno" puede significar uno o más. Como se usa en el presente documento en la(s) reivindicación (reivindicaciones), cuando se usa conjuntamente con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o", a menos que... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedades genéticas o anomalía genética que comprende determinar la presencia de una variación genética específica de tejido en un sujeto de prueba con respecto a una estructura genética de control seleccionada, que comprende:

(a) obtener material genético de una célula diferenciada de un tejido seleccionado, habiéndose preparado la célula diferenciando una célula pluripotente embrionaria inducida (¡PS) obtenida reprogramando una célula somática del sujeto; y

(b) probar el material genético de dicha célula diferenciada para comparar una o más estructuras genéticas de dicho material genético con una o más estructuras genéticas de control para determinar la presencia de una variación genética tal en células del tejido del sujeto.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene o se sospecha que tiene una anomalía genética o enfermedad genética.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho tejido seleccionado es retina.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha célula diferenciada es una célula neural de la retina o una célula de epitelio pigmentario de la retina (RPE).

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha prueba comprende secuenciación de ARN o ADN o en el que dicha prueba emplea análisis de micromatrices.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho material genético comprende ARN o ADN.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha estructura genética es una secuencia de nucleótidos o en el que dicha estructura genética se representa por un perfil de expresión sobre el nivel de ARN o nivel de proteína.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha variación genética

(a) es un polimorfismo;

(b) es una mutación génica;

(c) está representada por la expresión diferencial sobre el nivel de ARN o nivel de proteína;

(d) es una variación de una o más secuencias codificantes;

(e) es una variación de uno o más elementos reguladores de genes, o

(f) es una variación epigenética.

9. El procedimiento de la reivindicación 8(a), en el que dicha variación genética es una variación de polimorfismo de un solo nucleótido.

1. El procedimiento de la reivindicación 8(e), en el que dicho elemento regulador génico es un promotor, potenciador, silenciador o elemento de respuesta o microARN.

11. El procedimiento de la reivindicación 8(f), en el que dicha variación epigenética es variación en la metilación de la estructura genética.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la estructura genética de control

(a) es una conocida por no tener una variación genética seleccionada;

(b) está comprendida en material genético, en el que el material genético es de una célula normal seleccionada preparada diferenciando una célula iPS obtenida reprogramando una célula somática normal de un sujeto de control, o

(c) es de un sujeto de control que es un pariente del sujeto de prueba.

13. El procedimiento de la reivindicación 12(a), en el que la estructura genética de control está comprendida en material genético de un tejido normal.

14. El procedimiento bien de la reivindicación 12(b) o bien de la reivindicación 13, en el que el tejido normal o la célula normal seleccionada es del mismo tipo de tejido que el tejido seleccionado del sujeto de prueba.

15. El procedimiento de la reivindicación 12(c), en el que el sujeto de control es un hermano del sujeto de prueba.