Fibrinógeno terapéutico estable.

Fármaco, que contiene fibrinógeno seguro frente a virus como sustancia farmacéutica activa,

así como eventualmente complejos de monómero de fibrina,

caracterizado porque

los complejos de monómero de fibrina eventualmente presentes constituyen menos del 4% de la proteína total (fibrinógeno y complejos de monómero de fibrina) y porque el fármaco presenta menos de 1 μU de trombina por mg de fibrinógeno.

Fibrinïgeno terapïutico estable Introducciïn Las proteïnas terapïuticas se usan en medicina desde hace mïs de 100 aïos y siguen ganando interïs e importancia en la medicina. Comparaciones con otras sustancias farmacïuticas activas dan como resultado que las proteïnas terapïuticas como sustancias albuminoideas presentan una estabilidad considerablemente menor y un mayor grado de impurezas. Las proteïnas terapïuticas tambiïn presentan en comparaciïn con otros principios activos farmacïuticos una sensibilidad relativamente elevada frente a diferentes factores quïmicos y fïsicos, en particular frente a enzimas tales como proteasas, que escinden enlaces peptïdicos. Por tanto, todas las medidas que en la obtenciïn, la purificaciïn y el almacenamiento de proteïnas terapïuticas intactas contribuyen a mantener su integridad y estabilidad son de gran importancia econïmica.

Las modificaciones de proteïnas terapïuticas, y esto es aplicable a todas las proteïnas, pueden tener lugar mediante transposiciïn intramolecular o mediante reacciones quïmicas, tales como escisiïn o formaciïn de enlaces covalentes. Una enzima, que reconoce una proteïna terapïutica como su sustrato, puede modificar la misma en gran medida y, siempre que no se trate de una proteasa, provocar una o varias escisiones en la cadena peptïdica de la proteïna. Ya en los materiales de partida para la producciïn de proteïnas terapïuticas tanto naturales como obtenidas mediante ingenierïa genïtica pueden estar contenidas tales enzimas, asï como sus precursores, que se denominan proenzimas, o en el caso de las proteasas, tambiïn zimïgenos. Las enzimas que actïan sobre proteïnas son en la mayorïa de los casos proteïnas ellas mismas y pueden encontrarse tanto libres como ya unidas a sus sustratos. Los zimïgenos tambiïn pueden encontrarse como sustratos o estar ya unidos con sus enzimas especïficas, que las convierten en proteasas.

Las acciones enzimïticas sobre las proteïnas terapïuticas durante su producciïn y almacenamiento, partiendo del producto de partida hasta el producto terminado, pueden conducir a pïrdidas elevadas y productos finales lïbiles (Anderson et al. 1986; Eaton et al. 1986; Brummel et al. 1999) .

Ya en muchos materiales de partida estïn presentes enzimas, que actïan sobre las proteïnas terapïuticas, asï como sus proenzimas y procofactores, que durante la operaciïn de purificaciïn conduce a una formaciïn adicional de tales enzimas mediante activaciïn. Los procofactores son igualmente proteïnas, que mediante la acciïn de proteasas se degradan para dar cofactores, pero que no son enzimas en sï mismas. Los cofactores aumentan de manera especïfica determinadas actividades proteasa en un mïltiplo.

Tales enzimas, proenzimas, cofactores o procofactores pueden emplearse en sï mismos como proteïnas terapïuticas, siempre y cuando los agentes patïgenos virales, tal como pueden encontrarse en la sangre o biomasas obtenidas mediante ingenierïa genïtica, se inactiven o se agoten mediante operaciones de inactivaciïn o de eliminaciïn en el transcurso de la producciïn de la sustancia activa farmacïutica.

La cascada de coagulaciïn de sangre es uno de los sistemas enzimïticos mejor conocidos. Se desencadena por un cofactor enzimïtico, el factor tisular que contiene lïpidos, que aumenta la actividad enzimïtica del factor de coagulaciïn VIIa en un mïltiplo. El factor tisular aparece normalmente sïlo en cïlulas y por ello no puede interaccionar con el factor de coagulaciïn VIIa. Debido a acontecimientos patolïgicos o traumïticos, el factor tisular puede llegar a la superficie de cïlulas que contienen factor tisular, o salir de estas cïlulas. Con las cantidades reducidas de factor VIIa existentes siempre en la sangre puede desencadenarse entonces la cascada enzimïtica. El punto final de esta cascada de coagulaciïn es la enzima trombina, que se genera asï a travïs de la vïa extrïnseca y comïn, y convierte fibrinïgeno en fibrina. El fibrinïgeno, que tambiïn puede usarse como proteïna terapïutica, se escinde por parte de la trombina en monïmero de fibrina y fibrinopïptidos. El monïmero de fibrina se polimeriza para dar hebras de fibrina y finalmente para dar una red, que puede conducir en el lecho de la herida al cierre de una herida y por consiguiente a la finalizaciïn de una hemorragia. El fibrinïgeno no es ni una enzima ni tiene propiedades de cofactores (Lawson et al. 1994; Hemker 2002; Mann et al. 2002) .

Sin embargo, la trombina no actïa sïlo enzimïticamente sobre el fibrinïgeno, sino que tambiïn convierte, entre otras, la proenzima factor de coagulaciïn XIII en la enzima factor de coagulaciïn XIIIa. ïste provoca como transglutaminasa mediante reticulaciones de las hebras de fibrina en la estructura principal de fibrina tridimensional una estabilidad biomecïnica aumentada de la red de fibrina formada y tambiïn una protecciïn frente a la degradaciïn enzimïtica. En la sangre, o plasma, coagulada mediante la acciïn de la trombina se producen operaciones enzimïticas importantes adicionales, en particular la formaciïn de trombina a partir de la proenzima protrombina, el factor de coagulaciïn II. De este modo se produce un gran aumento de la concentraciïn de trombina en la sangre coagulada, lo que provoca no sïlo la conversiïn completa del factor de coagulaciïn XIII en XIIIa, sino tambiïn la activaciïn de la proenzima TAFI para dar enzima TAFIa. Esta enzima escinde de la fibrina un pïptido corto, que contienen receptores para un complejo enzimïtico fibrinolïtico y sirve asï para la resistencia de la fibrina frente a influencias fibrinolïticas. Para estas operaciones se requiere una concentraciïn relativamente elevada de trombina en la sangre ya coagulada, que puede generarse mediante la activaciïn de la protrombina presente en la sangre coagulada (Siebenlist et al. 2001) .

La producciïn fuertemente aumentada de la trombina en el propio coïgulo de sangre ya no se produce a travïs de la vïa de tenasa extrïnseca, sino a travïs de la vïa de tenasa intrïnseca y la comïn. Ya cantidades reducidas de trombina conducen en presencia de factor VIII y factor IXa y fosfolïpido activo para la coagulaciïn a la formaciïn del complejo de tenasa intrïnseca, que al igual que el complejo de tenasa extrïnseca, pero con una intensidad 50 veces mayor, provoca la activaciïn mediante escisiïn proteolïtica del factor de coagulaciïn X para dar Xa, que conduce entonces a la formaciïn de trombina mediante la activaciïn de la protrombina (Mutch et al. 2001) .

En operaciones de coagulaciïn fisiolïgicas asï como en las fisiopatolïgicas, determinadas estructuras fosfolipïdicas celulares provocan dentro de y en las cïlulas, en particular en las plaquetas, una fuerte aceleraciïn adicional de determinadas operaciones enzimïticas en la cascada de coagulaciïn, ademïs de los cofactores de alto peso molecular que aumentan la actividad.

Estado de la tïcnica Ya en los mïtodos hasta la fecha para la obtenciïn de proteïnas terapïuticas se han empleado condiciones de purificaciïn, que pretendïan minimizar las acciones de las enzimas sobre las proteïnas que iban a obtenerse, realizïndose por ejemplo la operaciïn de purificaciïn a temperaturas lo mïs bajas posible y/o mediante la inhibiciïn de inhibidores (Kunicki et al. 1987 y 1992; Johnson et al. 1994 y 1996; Rotblat et al. 1985) . A pesar de ello, este modo de proceder resultï ser insuficiente, en particular en el caso de proteïnas que se someten a una ligera escisiïn enzimïtica. Igualmente, no se hizo un seguimiento cuantitativo suficiente de la eliminaciïn de tales enzimas, sus proenzimas, cofactores y procofactores durante el procedimiento de purificaciïn y por consiguiente tampoco se tuvo en cuenta de manera suficiente la formaciïn posterior de tales enzimas durante todo el procedimiento de producciïn. Muchas de las proteïnas terapïuticas obtenidas hasta la fecha se caracterizaban por este motivo sïlo en un rendimiento insuficiente con una eficacia biolïgica modificada y reducida asï como con una elevada inestabilidad, en particular durante el almacenamiento necesario del fïrmaco terminado.

Los inhibidores enzimïticos usados hasta la fecha en la purificaciïn presentaban una concentraciïn y/o avidez reducida. Por ello, enzimas, que ya estaban unidas a su sustrato, sïlo podïan neutralizarse de manera insuficiente. Ademïs, tampoco se prestï atenciïn a mantener la concentraciïn de los inhibidores enzimïticos lo mïs constante posible durante la operaciïn de purificaciïn.

Las proteïnas terapïuticas obtenidas mediante ingenierïa genïtica pueden tener, ya durante su expresiïn y secreciïn desde cïlulas, enzimas proteolïticas unidas o unirse a aquïllas que estïn presentes... [Seguir leyendo]

1. Fïrmaco, que contiene fibrinïgeno seguro frente a virus como sustancia farmacïutica activa, asï como eventualmente complejos de monïmero de fibrina,

caracterizado porque los complejos de monïmero de fibrina eventualmente presentes constituyen menos del 4% de la proteïna total (fibrinïgeno y complejos de monïmero de fibrina) y porque el fïrmaco presenta menos de 1 !U de trombina por mg de fibrinïgeno.