PROCEDIMIENTO DE FERMENTACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS Y DERIVADOS QUE COMPRENDE LA UTILIZACION DE PREDADORES BACTERIANOS.

Procedimiento de fermentación para la producción de polihidroxialcanoatos y derivados que comprende la utilización de predadores bacterianos.

Procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho procedimiento de extracción porque comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior con una bacteria predadora en un medio que comprende una fuente de Ca y Mg. Preferiblemente la bacteria predadora Bdeílovibrio bacteriovorus HD100 y la bacteria productora presa es Pseudomonas putida KT2440 o Cupriavidus necator H16. Adicionalmente, también se describe un método de obtención del bioproducto que comprende la extracción por el procedimiento de la invención.

Procedimiento de fermentación para la producción de polihidroxialcanoatos y derivados que comprende la utilización de predadores bacterianos

SECTOR DE LA TÉCNICA

Uno de los objetos de la presente invención es un procedimiento de producción de polihidroxialcanoatos y derivados por fermentación bacteriana en el que se facilita la extracción del producto mediante la lisis de la bacteria productora con una bacteria predadora, y por tanto, se incluye en el área de la Biotecnología Industrial en el sector de la Industria Química, y en particular de la denominada Química Sostenible o Química Verde, pudiendo afectar tanto al subsector de las sustancias químicas primarias como al subsector de las sustancias químicas especializadas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La biotecnología de los bioprocesos industriales está experimentado en los últimos años avances considerables para mejorar y adaptar las modernas técnicas de la biología molecular y de la microbiología a las tecnologías clásicas de fermentación. En este sentido, la tecnología del DNA recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular, han sido determinantes para que podamos explotar y manipular un gran número de organismos para la producción de sustancias de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas para expresión de genes en organismos heterólogos más fáciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estudiar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, además, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como son los bioplásticos. Sin embargo, el uso de este tipo de biopolímeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la síntesis de los polímeros plásticos derivados del petróleo (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397-428).

Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la Implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energía y la producción de materiales de alto consumo como son los polímeros plásticos.

Los polihidroxialcanoatos, conocidos comúnmente como "bioplásticos", son polímeros blodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397-428).

Estos biopolímeros blodegradables son sintetizados por bacterias a partir de fuentes renovables como la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428). Por tanto, se puede definir el término bloplástlco como blopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser degradado en condiciones controladas de blodegradación y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la Industria petroleoquímica (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764-3768).

En general, los gránulos de PPIA están compuestos por un polléster que comprende 93-97% del peso seco del gránulo (PSG), rodeado por entre 1-6 % del PSG de fosfolípldos y entre 1-2 % del PSG de proteínas asociadas al gránulo (denominadas GAPs según sus siglas en inglés), las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Stelnbüchel et al. 1995. Can. J. Microbio!. 41: 94-105).

Los PFIAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PPIAs de cadena corta (scl- PFIAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PFIAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PFIAs Identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R. El peso molecular de estos polímeros puede variar entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter qulral. Estos polímeros, biopoliésteres, están formados únicamente por la forma enantiómérica R de los hidroxialcanoatos (RFIA) (Prieto et al. 1999. J. Bacteriol. 181: 858-868; Chen et al. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:592-599; Ren et al. 2010. Appl. Microbio!. Biotechnol. 87:41-52).

El scl-PPIA más abundante en bacterias y más estudiado hasta la fecha es el poli-(3-hidroxibutirato) (PHB), cuya ruta específica de síntesis ha sido ampliamente investigada en la cepa bacteriana Ralstonia eutropha H16, recientemente reclasificada como Cupriavidus necator FU6 (Poehlein et al. 2011. J. Bacteriol. 193: 5017). Este polímero se sintetiza a partir de acetil-CoA en una serie de tres reacciones consecutivas. En primer lugar se acoplan dos moléculas de

acetil-CoA, generando acetoacetil-CoA en una reacción de condensación catalizada por una (3-cetoacil-CoA tiolasa (PhbA). A continuación, el acetoacetil-CoA generado es reducido estereoselectivamente dando (R)-3-hidroxibutiril- CoA en una reacción catalizada por la acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADPH (PhbB). Finalmente, los monómeros de (R)-3-hidroxibutiril-CoA son polimerlzados por la acción de una pollmerasa de PHB (PhbC) (Peoples y Sinskey, 1989. J. Biol. Chem. 264: 15298-15303).

Los mcl-PHA producidos por el género Pseudomonas están compuestos mayo rita ría mente por monómeros de ácido hidroxioctanoico, pero también se pueden encontrar en menor porcentaje una gran diversidad de monómeros que contienen como sustituyentes grupos aromáticos, alifáticos, ¡nsaturados, saturados, con ramificaciones, etc. (García et al. 1999. J. Biol. Chem. 274: 29228-29241). Esto es debido principalmente a la gran diversidad metabólica que caracteriza a estos microorganismos ya que pueden transformar una gran variedad de sustratos en intermediarios 3- hidroxialcanoicos mediante la ruta de (3-oxidadón y de síntesis de novo de ácidos grasos (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428).

Se sabe que la composición del PFIA depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72: 278-288; Jung et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72:19-24). Por otra parte, es importante resaltar que las características físico-químicas de estos polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Fluisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 21-53). Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes en PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol. 41: 94-105), y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Flazer et al., 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 1-12), es fácil imaginar la gran diversidad de PFIAs y RFIAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PFIAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn et al. 2001. Adv. Drug. Deliv. Rev. 53: 5-21). Además, el PFIA puede ser considerado como una fuente de RFIAs, nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales.

Dentro de los costes de producción de los polihidroxialcanoatos (PFIA), el proceso de extracción es probablemente el paso más importante a la hora de reducir costes y resolver el proceso de forma respetuosa con el medio ambiente. Hasta ahora se han desarrollado diferentes métodos para extraer PHA, pero en su mayoría requieren el uso de disolventes orgánicos que son poco respetuosos con el medio ambiente, o cócteles enzimáticos o detergentes, que siendo más respetuosos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho procedimiento de extracción porque comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior con una bacteria predadora en un medio que comprende una fuente de Ca y

Mg.

2. Procedimiento de extracción según la reivindicación anterior, donde la bacteria predadora pertenece al grupo de los BALOs.

3. Procedimiento de extracción según la reivindicación 2, donde la bacteria predadora es Bdellovibrio bacteriovorus HD100.

4. Procedimiento de extracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la bacteria productora presa es una bacteria Gram-negativa.

5. Procedimiento de extracción según la reivindicación 4, donde la bacteria Gram-negativa es Pseudomonas putida KT2440.

6. Procedimiento de extracción según la reivindicación 4, donde la bacteria Gram-negativa es Cupriavidus necator H16.

7. Procedimiento de extracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionar la bacteria predadora a un medio de cultivo que comprende una fuente de Ca y Mg donde se encuentra la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior.

8. Método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho método porque comprende:

a) cultivar la bacteria productora presa en un medio de cultivo para producir el bioproducto,

b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

c) aislar el bioproducto.

9. Método de obtención según la reivindicación 8, donde la etapa a) comprende cultivar Pseudomonas putida KT2440 en un medio mínimo de cultivo para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA.

10. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde la etapa c) comprende aislar PHA.

11. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, donde la etapa c) comprende aislar el hidrolizado de PHA.

12. Método de obtención según la reivindicación 8, donde el bioproducto se selecciona del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y el método comprende:

a) cultivar la bacteria productora presa en un medio rico de cultivo en el que se produce el bioproducto,

b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

c) aislar el bioproducto.

13. Método de obtención según la reivindicación 12, donde la etapa a) comprende cultivar Cupriavidus necator en un medio rico de cultivo (NB) suplementado con gluconato sódico para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA.

14. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, donde la etapa c) comprende aislar PHA o el hidrolizado de PHA.