Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm.

Un compuesto oligonucleotídico capaz de inducir el salto del exón 45 del gen de la distrofina,

que es un oligonucleótido representado por la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº 15, 14 y 16 donde al menos uno de los nucleósidos que constituye el oligonucleótido está modificado por 2'-O,4'-C alquilenación de D-ribofuranosa o un compuesto representado por la fórmula general (III'); o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, opcionalmente donde al menos uno de los azúcares y/o los fosfatos que constituyen el oligonucleótido está modificado, donde dicha fórmula general (III) se define del siguiente modo: BT'3-BM'3-BB'3 (III')

donde BT'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (3a') a (3c'):

(3a')HO-, (3b')HO-Bc-, o (3c')HO-Bg-Bc-

BM'3 es un grupo representado por la siguiente fórmula (3'):

-Bc-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bc-Bc-Ba-Ba- (3')

BB'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (32a') a (32i'):

(32a')-CH2CH2OH, (32b')-Bt-CH2CH2OH,

(32c')-Bt-Bg-CH2CH2OH, (32d')-Bt-Bg-Bc-CH2CH2OH,

(32e')-Bt-Bg-Bc-Bc-CH2CH2OH, (32f')-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-CH2CH2OH,

(32g')-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-CH2CH2OH, (32h')-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-CH2CH2OH, o

(32i')-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-Bc-CH2CH2OH,

donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2); Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2); Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2); y Bt es un grupo representado por la siguiente fórmula (U1) o (T2):**Fórmula**

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09011130.

Solicitante: Matsuo, Masafumi.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: Department of Medical Rehabilitation, Faculty of Rehabilitation Kobegakuin University, 518 Arise, Ikawadani-cho, Nishi-ku, Kobe-shi Hyogo 651-2180 JAPON.

Inventor/es: KOIZUMI, MAKOTO, MATSUO,MASAFUMI, TAKESHIMA,YASUHIRO.

Fecha de Publicación: 17 de Septiembre de 2014.

Clasificación Internacional de Patentes:

A61K31/7088 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Compuestos que tienen al menos tres nucleósidos o nucleótidos.
A61K31/712 A61K 31/00 […] › Acidos nucleicos u oligonucleótidos que tienen azúcares modificados, es decir distintos de la ribosa o la 2'-desoxirribosa.
A61K31/7125 A61K 31/00 […] › Acidos nucleicos u oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosidos modificados, es decir distintos de los enlaces 3'-5' fosfodiester.
A61K38/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
A61P21/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 21/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema muscular o neuromuscular. › para la miastenia grave.
C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
C12N15/113 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.

PDF original: ES-2509140_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm

Campo técnico La presente invención se refiere a agentes farmacéuticos de ácido nucleico ENA capaces de modificar el corte y empalme de precursores de ARNm. Más específicamente, la presente invención se refiere a compuestos de oligonucleótido antisentido para secuencias potenciadoras del corte y empalme en el exón 45 del gen de la distrofina, así como agentes terapéuticos para la distrofia muscular que comprenden los compuestos.

Técnica antecedente La distrofia muscular, que es una enfermedad muscular genética, se clasifica de forma aproximada en distrofia muscular de Duchenne (DMD) y distrofia muscular de Becker (BMD) . La DMD es la enfermedad muscular genética que aparece más frecuentemente y sucede en una proporción de 1 por 3.500 nacimientos de varones. Los pacientes de DMD muestran síntomas de debilitación de los músculos en su niñez; después de ello, la atrofia muscular progresa de forma constante y provoca la muerte a la edad de aproximadamente 20. Actualmente, no existe agente terapéutico eficaz para DMD. El desarrollo de agentes terapéuticos está fuertemente demandado por pacientes con DMD en todo el mundo. La BMD en muchos casos sucede en la adultez y la mayoría de los pacientes son capaces de una supervivencia normal aunque se observa ligera debilitación de los músculos. Se han identificado mutaciones de deleciones en el gen de la distrofina en 2/3 casos de DMD y BMD. El progreso de los síntomas clínicos en pacientes con DMD o BMD es predecible dependiendo de si dichas deleciones alteran la fase de lectura traduccional del ARNm o mantienen esa fase de lectura (Monaco A.P. et al., Genomics 1988: 2:90-95) . Aunque la biología molecular para comprender la DMD se ha profundizado de este modo, aún no se ha establecido un método eficaz para tratar la DMD.

Cuando los pacientes de DMD tienen una mutación de desplazamiento de fase, la proteína distrofina desaparece completamente de los músculos esqueléticos de los pacientes. Por otro lado, la proteína distrofina se produce a 30 partir de ARNm en fase en tejidos musculares derivados de pacientes con BMD, aunque la proteína está incompleta. Como método para tratar la DMD, se conoce un método en que una mutación fuera de fase (la fase de lectura de aminoácidos está desplazada) se convierte en una mutación en fase (la fase de lectura se mantiene) modificando el ARNm de la distrofina (Matsuo M., Brain Dev 1996; 18:167-172) . Recientemente, se ha informado de que el ratón mdx sintetizaba una distrofina que contiene deleción como resultado de la inducción de salto de exón con un oligonucleótido complementario a la secuencia consenso de corte y empalme del gen de la distrofina (Wilton S.D. et al., Neuromusc Disord 1999: 9:330-338; Mann C.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001: 98:42-47) . En estos estudios, el salto de exón se induce usando como diana la secuencia consenso de corte y empalme localizada en el límite entre dos exones.

Se asevera que el corte y empalme está regulado por secuencias potenciadoras de corte y empalme (SES) . De hecho, se ha demostrado que alterando las SES en el exón 19 del gen de la distrofina con un oligonucleótido antisentido complementario al mismo, sucede un salto completo del exón 19 en células linfoblastoides normales (Takeshima Y et al., J Clin Invest 1995: 95:515-520; Pramono Z.A. et al., Biochem Biophys Res Commun 1996: 226:445-449) .

También se ha informado de que introduciendo un oligonucleótido complementario a la SES en el exón 19 del gen de la distrofina para inducir de este modo el salto de exón, se producía satisfactoriamente una distrofina que contiene deleción en células musculares derivadas de pacientes con DMD que portan deleción del exón 20 (Takeshima Y et al., Brain & Development 2001: 23:788-790; publicación de patente japonesa no examinada Nº

H11-140930; publicación de patente japonesa no examinada Nº 2002-10790) . Esto indica que reparando el desplazamiento de la fase de lectura induciendo un salto del exón 19 con un oligonucleótido antisentido complementario a la SES en el exón 19 del gen de la distrofina se provoca la producción de una proteína distrofina cuya función está parcialmente restaurada; y por tanto es posible cambiar de DMD a BMD. Si es posible convertir la DMD, una miostrofia grave, en BMD ligera, puede esperarse prolongar las vidas de los pacientes.

Actualmente, se están desarrollando análogos oligonucleotídicos que tienen actividad antisentido estable y excelente (publicación de patente japonesa no examinada Nº 2000-297097) .

Aartsma-Rus et al. (Neuromuscular Disorders (2002) 12-S71-S77) analizan terapias de corrección génica dirigidas a 60 la restauración de la fase de lectura en pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Aartsma-Rus et al. informan de que oligonucleótidos antisentido podrían inducir el salto de 11 exones de distrofia muscular de Duchenne en células musculares humanas cultivadas. El documento WO 2004/083446 describe métodos para generar oligonucleótidos con que puede saltarse un exón en un pre-ARNm y por tanto para excluirse de un ARNm producido del mismo.

El documento EP-A-1 191 098 describe un ADN que representa la secuencia potenciadora de corte y empalme (SES) en el exón 45 del gen humano de la distrofina, y sugiere que este ADN sirve como molde en la preparación del oligonucleótido antisentido, que puede usarse para inducir el salto del exón 45 para restaurar la fase de lectura del ARNm de la distrofina.

Un objeto de la presente invención es proporcionar agentes terapéuticos con rango de aplicación más amplio y mayor eficacia, mejorando los oligonucleótidos antisentido para la SES en el exón 45 del gen de la distrofina.

Descripción de la invención Como resultado de investigaciones extensivas e intensivas hacia la consecución del objeto descrito anteriormente, los presentes inventores han conseguido diseñar y sintetizar esas secuencias de nucleótidos y compuestos de oligonucleótido antisentido que tienen mayor efecto de salto de exón sobre el exón 45 del gen de la distrofina. Por tanto, la presente invención se ha conseguido.

La presente invención puede resumirse del siguiente modo.

[1] Un compuesto oligonucleotídico capaz de inducir el salto del exón 45 del gen de la distrofina, que es un oligonucleótido representado por la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº 15,

14 y 16 donde al menos uno de los nucleósidos que constituyen el oligonucleótido está modificado 2'-O, 4'-C alquilenación de D-ribofuranosa o un compuesto representado por la fórmula general (III') ; o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, opcionalmente donde al menos uno de los azúcares y/o los fosfatos que constituyen el oligonucleótido está modificado, donde dicha fórmula general (III') se define del siguiente modo:

BT'3-BM'3-BB'3 (III')

donde BT'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (3a') a (3c') :

(3a') HO-, (3b') HO-Bc-, o (3c') HO-Bg-BcBM'3 es un grupo representado por la siguiente fórmula (3') :

- Bc-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bc-Bc-Ba-Ba- (3')

BB'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (32a') a (32i') : (32a') -CH2CH2OH, (32b') -Bt-CH2CH2OH, (32c') -Bt-Bg-CH2CH2OH, (32d') -Bt-Bg-Bc-CH2CH2OH, (32e') -Bt-Bg-Bc-Bc-CH2CH2OH, (32f') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-CH2CH2OH, (32g') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-CH2CH2OH, (32h') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-CH2CH2OH, o (32i') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-Bc-CH2CH2OH, donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2) ; Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2) ; Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2) ; y Bt es un grupo representado por la siguiente fórmula (U1) o (T2) :

donde X es individual e independientemente un grupo representado por la siguiente fórmula (XI) o (X2) :

Y es individual e independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi con 1-6 átomos de carbono; y Z es individual e independientemente un enlace sencillo o un grupo alquileno con 1-5 átomos de carbono; con la condición de que al menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la fórmula (III') tenga un grupo 2'-O, 4'-C-alquileno.

[2] El compuesto de [1] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde el azúcar que constituye el oligonucleótido es D-ribofuranosa y la modificación del azúcar es 2'-O-alquilación y/o 2'-O, 4'-Calquilenación de la D-ribofuranosa.

[3] El compuesto de [1] o [2] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde la modificación del... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un compuesto oligonucleotídico capaz de inducir el salto del exón 45 del gen de la distrofina, que es un oligonucleótido representado por la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº 15, 14 y

16 donde al menos uno de los nucleósidos que constituye el oligonucleótido está modificado po.

2. O, 4'-C alquilenación de D-ribofuranosa o un compuesto representado por la fórmula general (III') ; o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, opcionalmente donde al menos uno de los azúcares y/o los fosfatos que constituyen el oligonucleótido está modificado, donde dicha fórmula general (III) se define del siguiente modo:

BT'3-BM'3-BB'3 (III')

donde BT'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (3a') a (3c') :

(3a') HO-, (3b') HO-Bc-, o (3c') HO-Bg-Bc15 BM'3 es un grupo representado por la siguiente fórmula (3') :

- Bc-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bc-Bc-Ba-Ba- (3')

BB'3 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (32a') a (32i') :

(32a') -CH2CH2OH, (32b') -Bt-CH2CH2OH, (32c') -Bt-Bg-CH2CH2OH, (32d') -Bt-Bg-Bc-CH2CH2OH, (32e') -Bt-Bg-Bc-Bc-CH2CH2OH, (32f') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-CH2CH2OH, (32g') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-CH2CH2OH, (32h') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-CH2CH2OH, o (32i') -Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bt-Bc-Bc-CH2CH2OH,

donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2) ; Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2) ; Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2) ; y Bt es un

donde X es individual e independientemente un grupo representado por la siguiente fórmula (X1) o (X2) :

2. O, 4'-C-alquileno.

2. El compuesto o sal farmacológicamente aceptable de acuerdo con la reivindicación 1 donde el azúcar que constituye el oligonucleótido es D-ribofuranosa y la modificación del azúcar e.

2. O-alquilación y/.

2. O, 4'-Calquilenación de la D-ribofuranosa.

3. El compuesto o sal farmacológicamente aceptable de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde la modificación del fosfato es tioación del grupo fosfato.

4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está representado por una

cualquiera de las fórmulas seleccionadas entre el grupo que consiste en (A033) , (AO85 (AO88) y (AO86) , o una sal farmacológicamente aceptable de los mismos (AO33) : HO-Ge2p-Ce2p-Ce2p-Ge2p-Ce2p-Ump-Gmp-Cmp-Cmp-Cmp-Ae2p-Ae2p-Te2p-Ge2p-Ce2p-CH2CH2OH (SEC ID Nº 14) (AO85) : HO-Ce2p-Gmp-Ce2p-Te2p-Gmp-Cmp-Ce2p-Ce2p-Amp-Amp-Te2p-Gmp-Ce2p-Ce2p-Amp-Ump-Ce2p-Ce2p-CH2CH2OH (SEC ID Nº 15)

(AO88) : HO-Ce2s-Gms-Ce2s-Te2s-Gms-Cms-Ce2s-Ce2s-Ams-Ams-Te2s-Gms-Ce2s-Ce2s-Ams-Ums-Ce2s-Ce2s-CH2CH2OH (SEC ID Nº 15) (AO86) : HO-Ce2p-Amp-Gmp-Te2p-Te2p-Ump-Gmp-Ce2p-Ce2p-Gmp-Ce2p-Te2p-Gmp-Ce2p-Ce2p-Ce2p-Amp-Amp-CH2CH2OH (SEC ID Nº 16) donde Ae1p, Ge1p, Ce1p, Te1p, Ae2p, Ge2p, Ce2p, Te2p, Amp, Gmp, Cmp, Ump, Ae1s, Ge1s, Ce1s, Te1s, Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2s, Ams,

Gms, Cms, y Ums son grupos que tienen las siguientes estructuras, respectivamente:

5. Un agente terapéutico para la distrofia muscular, que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.

6. El agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 5, cuya diana de tratamiento es aquellos pacientes en los que la cantidad total de aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 45 del gen de la distrofina se ha saltado.

7. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un agente terapéutico de acuerdo 10 con la reivindicación 5 ó 6 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular.

8. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para tratar la distrofia muscular.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde la diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad total de aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 45 del gen de la distrofina se ha saltado.

10. Un agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, un compuesto o agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 7 o un uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 donde dicha distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne.

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