Factor neurotrófico MANF y usos del mismo.

Vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia de promotor que puede dirigir la expresión de un polipéptido operativamente unido en una célula de mamífero,

comprendiendo dicho polipéptido un polipéptido de MANF tal como se expone en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o lesión cerebral isquémica.

Factor neurotrófico MANF y usos del mismo

Campo de la invención La presente invención se refiere de manera general al campo del tratamiento de trastornos neuronales y más particularmente a factores de crecimiento para células neurales, especialmente para neuronas dopaminérgicas en el SNC (sistema nervioso central) y a genes de factores de crecimiento. La presente invención también se refiere a los campos de vectores de administración génica y de terapia génica.

Antecedentes de la invención El factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF) se ha descrito como factor de supervivencia para neuronas dopaminérgicas in vitro (Petrova et al., 2003; documento WO 01/19851; y documento WO 02/074956) , pero se sabe poco de su expresión en tejidos de mamífero. Recientemente se caracterizó una proteína homóloga, el factor neurotrófico dopaminérgico conservado (CDNF) , que protege y rescata neuronas dopaminérgicas in vivo (Lindholm et al., 2007; documento WO 2007/068784; y documento WO 2007/068803) . Las proteínas MANF y CDNF forman una familia evolutivamente conservada novedosa de factores neurotróficos.

Los factores neurotróficos son proteínas secretadas que fomentan la supervivencia neuronal y potencian la formación y el mantenimiento de conexiones neuronales en el sistema nervioso de vertebrados (Huang y Reichardt, 2001; Airaksinen y Saarma, 2002) . El papel de los factores neurotróficos está bien caracterizado, principalmente en el sistema nervioso periférico (SNP) . En los últimos años, también se ha acumulado una cantidad sustancial de conocimiento sobre la implicación de factores de crecimiento en la regulación del desarrollo y mantenimiento de poblaciones neuronales en el sistema nervioso central (SNC) .

Los síntomas motores característicos de la enfermedad de Parkinson (EP) resultan de la degeneración gradual de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo. Varios factores de crecimiento pueden actuar como factores de supervivencia para neuronas dopaminérgicas (Krieglstein, 2004; Bespalov y Saarma, 2007) , pero todavía se desconocen sus papeles en el desarrollo y mantenimiento de estas neuronas in vivo. El factor neurotrófico derivado de línea celular de la glía (GDNF; Lin et al., 1993) protege e incluso repara el sistema dopaminérgico en modelos de roedores y primates de EP (Hoffer et al., 1994; Sauer et al., 1995; Kearns y Gash, 1995; Tomac et al., 1995; Gash et al., 1996; Grondin et al., 2002) . Sin embargo, los resultados de ensayos clínicos con GDNF en pacientes con Parkinson han sido controvertidos, ya que se ha notificado o bien mejora clínica (Gill et al., 2003; Patel et al., 2005) o bien baja eficacia clínica (Lang et al., 2006) . Por tanto, está sumamente justificada la identificación y caracterización de nuevos factores que puedan ser neuroprotectores y soporten la neurorrestauración funcional.

Los ataques isquémicos y epilépticos, que están asociados con muerte neuronal, desencadenan cambios en la expresión de varios factores neurotróficos en el cerebro tales como la familia de GDNF (Kokaia et al., 1999; Arvidsson et al., 2001) y las neurotrofinas, por ejemplo, BDNF (Ernfors et al., 1991; Lindvall et al., 1992) . Los cambios en los niveles de factores neurotróficos tras ataques cerebrales pueden regular la supervivencia celular, plasticidad sináptica, epileptogénesis y neurogénesis a partir de células madre neurales endógenas (Binder et al., 2001; Gustafsson et al., 2003; Jin et al., 2003; Kuipers y Bramham, 2006; SchÃbitz et al., 2007) . Por tanto, la 45 modulación de niveles de factores neurotróficos puede ser de valor terapéutico en estados isquémicos y epilépticos.

Hace algunos años se describió un factor neurotrófico novedoso, el factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF; también conocido como rico en arginina, mutado, en tumores en estadio temprano; ARMET) como factor promotor de la supervivencia para neuronas dopaminérgicas de mesencéfalo embrionario in vitro (Petrova et al., 2003) . El efecto promotor de la supervivencia observado de MANF era específico para neuronas dopaminérgicas, y no se detectaron efectos sobre neuronas serotoninérgicas o gabaérgicas (Petrova et al., 2003) . El presente grupo caracterizó recientemente un parálogo de MANF específico de vertebrados, denominado factor neurotrófico dopaminérgico conservado (CDNF) . CDNF (similar a ARMET 1) protege y rescata neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo in vivo en un modelo de 6-OHDA de rata de enfermedad de Parkinson (Lindholm et

al., 2007) . Las proteínas MANF y CDNF forman una nueva familia de factores evolutivamente conservados (Lindholm et al., 2007) . De manera importante, los efectos de MANF y CDNF sobre neuronas dopaminérgicas sugieren que estos factores pueden usarse en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos (Petrova et al., 2003, Lindholm et al., 2007) . Sin embargo, todavía faltan datos in vivo de MANF. Además, debe observarse que, basándose en secuencias de EST y genómicas de MANF, se concluyó que, al contrario que la secuencia notificada por Petrova et al. (2003) , el documento WO 01/19851 y el documento WO 02/074956, el aminoácido 176 de MANF humano es arginina (R) en vez de prolina (P) . A la luz de esto, parece que algunos de los trabajos anteriores relacionados con MANF se realizaron con un polipéptido de MANF que tiene una sustitución de aminoácido en la posición 176, y por tanto los resultados de estos experimentos no son relevantes para la presente invención (véase también el ejemplo 9) .

El documento WO 2005/005471 da a conocer proteínas DG153 y DG177 secretadas por el páncreas en desarrollo y

se refiere al diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades pancreáticas tales como diabetes y síndrome metabólico mediante el uso de la proteína DG153 o DG177. La secuencia de SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/005471 que da a conocer la secuencia de aminoácidos de la proteína DG153 tiene una homología del 100% con secuencia de aminoácidos de MANF de SEQ ID NO: 2 en la presente solicitud.

El documento WO 02/079246 describe polipéptidos y composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer. La secuencia de SEQ ID NO: 13 del documento WO 02/079246 es idéntica a la secuencia de aminoácidos de MANF de SEQ ID NO: 2 en la presente solicitud. Además, la secuencia de SEQ ID NO: 14 del documento WO 02/079246 es idéntica a la secuencia de aminoácidos de MANF de SEQ ID NO: 4 en la presente solicitud.

Chiocco et al. (Parkinsonism & related disorders, 2007, 13:321-328) y Zhou et al. (Neuroreport, 2006, 17:293-297) describen que puede usarse un polipéptido de MANF para el tratamiento de trastornos neurológicos tales como enfermedad de Parkinson, sin embargo, los artículos no dan a conocer ninguna secuencia de aminoácidos para el

polipéptido de MANF.

El documento WO 2004/087874 da a conocer polipéptidos aislados novedosos, polinucleótidos aislados novedosos que codifican para los polipéptidos, y vectores virales para terapia génica que comprenden los polinucleótidos. La secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 195 en el documento WO 2004/087874 comprende la secuencia de ácido nucleico de MANF de SEQ ID NO: dada a conocer en la presente solicitud.

En esta invención, se caracteriza la distribución de proteína y ARNm de Manf en el cerebro en desarrollo y adulto y en tejidos no neuronales. También se descubrió el efecto de MANF en estados patológicos, tales como enfermedad de Parkinson, estado epiléptico e isquemia prosencefálica global (es decir accidente cerebrovascular) .

Sumario de la invención La invención se describe mediante las reivindicaciones.

Se describe una proteína factor neurotrófico, MANF, y una secuencia genética que codifica para la misma. Las moléculas de MANF, es decir los ácidos nucleicos de MANF y polipéptidos de MANF, serán útiles en el desarrollo de una variedad de productos terapéuticos y productos de diagnóstico útiles en el tratamiento, la profilaxis y/o el diagnóstico de estados dependientes de MANF. Las moléculas de MANF también son efectores útiles de neuronas primarias y centrales.

El polipéptido de MANF aislado o recombinante puede estar glicosilado de manera natural o puede comprender un patrón de glicosilación alterado dependiendo de las células a partir de las cuales se aísla o se sintetiza. Por ejemplo, si se produce por medios recombinantes en organismos procariotas, la molécula no estará glicosilada. La molécula puede ser una forma que se produce de manera natural, de longitud completa, o puede ser una forma truncada o derivatizada de otro modo. Polipéptidos de MANF particularmente... [Seguir leyendo]

1. Vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia de promotor que puede dirigir la expresión de un polipéptido operativamente unido en una célula de mamífero, comprendiendo dicho polipéptido un polipéptido de MANF tal como se expone en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o lesión cerebral isquémica.

2. Vector según la reivindicación 1, seleccionándose el vector del grupo que consiste en VIH, VIS, VIF, VAIE, VAA,

adenovirus, retrovirus, herpesvirus. 10

3. Vector según la reivindicación 2, en el que el vector es un vector de lentivirus.

4. Composición farmacéutica que comprende el vector según la reivindicación 1 y uno o más adyuvantes,

excipientes, portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso en el tratamiento de enfermedad de 15 Parkinson o lesión cerebral isquémica.

5. Polipéptido de MANF aislado y purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o lesión cerebral isquémica.

6. Uso de un animal no humano transgénico, que contiene un gen de MANF humano que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 como transgén, como animal de prueba para reactivos que posiblemente confieren protección frente a enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson y lesión cerebral isquémica.

7. Composición farmacéutica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o lesión cerebral isquémica, y que comprende además CDNF, GDNF o fosfolípidos.