Estructura cristalográfica de proteínas Mnk-1 y Mnk-2.

Cinasa Mnk-2 humana cristalina, que tiene un grupo espaciador P3221 y dimensiones de celda unitaria de a ≥

4,5 Å ± 3 Å, b ≥ 104,5 Å ± 3 Å y c ≥ 72,35 Å ± 3 Å.

Estructura cristalográfica de proteínas mnk-1 y mnk-2

La presente invención se refiere a las proteínas Mnk-1 y Mnk-2 cristalinas y, en particular, a la estructura cristalina de los dominios de cinasa de Mnk-1 y Mnk-2.

El documento WO 03/037362 divulga proteínas homólogas a Mnk que regulan la homeostasis de la energía, el metabolismo de triglicéridos y/o contribuye a la estabilidad de la membrana y/o a la función de orgánulos y polinucleótidos, que identifican y codifican las proteínas divulgadas en el documento WO 03/035362. Adicionalmente, el documento WO 03/037362 se refiere al uso de estas secuencias en el diagnóstico, el estudio, la prevención y el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y la dermogénesis, por ejemplo, pero limitado a enfermedades metabólicas, tales como obesidad así como trastornos relacionados.

Jonathan Goldberg et al. (Goldberg Jonathan et al., Cell, vol. 83, Nº 6, 1996, 875-887) se refiere a la base estructural para la autoinhibición de la proteína cinasa I dependiente de calcio/calmodulina. De acuerdo con los autores de Goldberg et al., la estructura proporciona una vista de una diana de calmodulina intacta y sugiere que géneros estructurales sustanciales acompañarán la activación de cinasa por unión de calmodulina a la región reguladora.

Underwood et al., (Underwood et al., Structure, vol. 11, Nº 6, junio de 2003, 627-636) determinaron las estructuras cristalinas de una deleción C-terminal catalíticamente activa de los restos 41-364 de Mk2 humana en complejo con estaurosporina a 2, 7 Ã y con ATP a 3, 2 Ã lo que revela una similitud estructural general con otras Ser-Thr cinasas.

En seres humanos, se conocen más de 500 cinasas que median la transferencia de grupos fosfato a partir de nucleótidos a sustratos de proteína. Un entendimiento detallado del reconocimiento del sustrato, la regulación y la catálisis mediante proteínas cinasas es fundamental para tener una visión de conjunto de rutas biológicas diversas, muchas de las cuales tienen relaciones directas con enfermedades ampliamente esparcidas. La estructura cristalina de la proteína cinasa dependiente de AMPc ha proporcionado una primera imagen de alta resolución de la arquitectura molecular de proteínas cinasas (Knighton et al., Science 253 (5018) (1991) 407-414) .

Las estructuras cristalinas de diferentes proteínas cinasas humanas proporcionan visiones valiosas del mecanismo catalítico y regulador y ayudan al diseño de inhibidores específicos.

Por lo tanto, la materia objeto de la presente invención es proteína Mnk-2 humana cristalina y proteína Mnk-1 humana cristalina, métodos para la fabricación y aplicaciones de las mismas.

En particular, la invención se refiere cinasa Mnk-2 humana cristalina, que tiene un grupo espaciador P3221 y dimensiones de celda unitaria de a = 104, 5 à ± 3 Ã, b=104, 5 ñ 3Ãyc =72, 35ñ 3Ã.

Adicionalmente, la invención se refiere a una cinasa Mnk-1 humana cristalina, que tiene un grupo espaciador P43212 y dimensiones de celda unitaria de a = 93, 5 Ã, b = 93, 5 Ã y c=175, 2 Ã.

Además, la invención se refiere a un método para producir una preparación de cinasa Mnk-2 humana cristalina de 45 acuerdo con la invención, que comprende las etapas de (i) expresión de cinasa Mnk-2 humana en células, (ii) lisar las células para recuperar una preparación de cinasa Mnk-2 en bruto, (iii) purificar la preparación de cinasa Mnk-2 en bruto, (iv) cristalizar la cinasa Mnk-2 purificada, donde los cristales se crecen por difusión de vapor.

Además, la invención se refiere a un método para producir una preparación de cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de (i) expresión de cinasa Mnk-1 humana en células, (ii) lisar las células para recuperar una preparación de cinasa Mnk-1 en bruto, (iii) purificar la preparación de cinasa Mnk-1 en bruto, (iv) cristalizar la cinasa Mnk-1 purificada, donde los cristales se crecen por difusión de vapor.

En una primera realización, la presente invención se refiere a cinasa-2 que interactúa con cinasa activada por

mitógeno (MAP) de serina-treonina cinasas humanas, que también se cita como proteína Mnk-2. Se encuentran cuatro proteínas Mnk en seres humanos, a saber, dos isoformas Mnk-1 y Mnk-2, en la que la última existe como dos variantes de escisión, Mnk-2a y Mnk-2b. También se ha descrito una variante de escisión Mnk-1b. Los dominios de cinasa de Mnk-2a y Mnk-2b son idénticos. Se ha demostrado que las proteínas Mnk pueden activarse por miembros de la familia de MAP cinasa. Específicamente, pueden cumplir esta función las cinasas p38 inducidas por estrés y las proteínas Erk1/2 activadas por mitógeno. Mnk-1 y Mnk-2 se activan a través de una ruta similar y muestran especificidades de sustrato similares. Su secuencia de aminoácidos dentro del dominio de cinasa es ampliamente similar y los aminoácidos mencionados más adelante son idénticos. Las cinasa Mnk puede, de esta manera, constituir un punto de convergencia de estas dos vías de MAP cinasa.

Las proteínas Mnk son una subfamilia de la familia de las proteínas cinasa activadas por MAP cinasas (MAPKAPK) de proteínas cinasas que, a su vez, pertenecen al grupo de cinasas moduladas por Ca/calmodulina (CAMK) .

Las Mnk se activan mediante fosforilación mediante dos de las tres cascadas de MAPK: proteínas cinasas reguladas por señal extracelular de factor de crecimiento estimulado por Ras (ERK) 1/2 y la vía de p38 inducida por estrés (Fukunaga et al., Embo J. (16) (1997) 1921-1933; Embo J. (16) (1997) 1909-1910) . Las dos isoformas de Mnk de mamífero, Mnk-1 y Mnk-2, fosforilan al factor 4E de iniciación eucariótico (elF4E) in vitro e in vivo (Scheper et al., Eur 5 J. Biochem. (269) (2001) 5350-5359; Ueda et al., Mol. Cell Biol. (24) (2004) 6539-6549; Waskiewicz et al., Mol. Cell Biol. (19) (1999) 1871-1880) . elF4E es un componente esencial del complejo de iniciación de la traducción y une las estructuras CAP de ARN mensajeros eucariotas (Marcotrigiano et al., Cell (89) (1997) 951-961) . La fosforilación de elF4E mediada por Mnk parece estimular la traducción de ARNm específicos, por ejemplo, de RFLAT-1 o transcritos virales (Nikolcheva et al., Clin. Invest. (110) (2002) 119-126; Walsh et al., Genet. Dev. 18 (2004) 660-672) . Además,

Mnk-1 disminuye la traducción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante fosforilación de hnRNPA1 y puede por lo tanto jugar un papel en enfermedades inflamatorias (Buxade, 2005, Immunity 23, 177-189) La implicación de las Mnk en el metabolismo lipídico, la inflamación y la traducción viral las define como una diana para intervención farmacéutica.

El alineamiento de secuencias con otros miembros del grupo de CAMK reveló varias características singulares de las proteínas Mnk. Para revelar las consecuencias de esta observación en términos estructurales y funcionales, se efectuó un estudio cristalográfico con Mnk-2. De acuerdo con la invención, se obtuvo una estructura cristalina de 2, 1Ã del dominio de cinasa de Mnk2. Los resultados demuestran que la enzima Apo de Mnk-2 muestra una conformación inusualmente abierta de un segmento que corresponde al subdominio XII del esquema de Hanks incluyendo el extremo C-terminal del bucle de activación y del bucle P+1 (Hanks et al., Methods Enzymol. 200 (1991) 38-62) . Se sabe que el bucle P+1 es importante para la unión al sustrato.

El equivalente del motivo DFG de unión a magnesio, que está conservado como DFD en proteínas Mnk, sobresale dentro del bolsillo de unión a ATP y obstruye la unión de nucleótidos. Por lo tanto, el DF (G/D) conservado al

comienzo del bucle de activación adopta una conformación que inhibe la unión a ATP (citado como conformación DF (G/D) OUT) . Esto revela un mecanismo inhibidor que regula la unión de nucleótidos, lo que contrasta con otras cinasas de estructura conocida del grupo de CAMK, donde la hendidura de unión a ATP está accesible en la enzima Apo no fosforilada (conformación DF (G/D) IN) . Esta es la primera observación de una conformación DF (G/D) OUT en una enzima Apo de Ser/Thr cinasa.

Adicionalmente, se descubrió un motivo de coordinación con cinc en el bucle C que no se había descrito en proteínas cinasas anteriormente. El dominio de cinasa de Mnk-2 contiene una inserción de 15 restos en el bucle C que está conservada en longitud y secuencia en las proteínas Mnk pero que está ausente en otras cinasas. Cuatro cisteínas conservadas en esta inserción sirven como sitio de unión a cinc, según se revela por la estructura de Mnk

2 presentada en el presente documento.... [Seguir leyendo]

1. Cinasa Mnk-2 humana cristalina, que tiene un grupo espaciador P3221 y dimensiones de celda unitaria de a =

104, 5 à ± 3 Ã, b=104, 5 ñ3Ãy c=72, 35 ñ3 Ã. 5

2. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 1, donde es cinasa Mnk-2a humana cristalina.

3. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la cinasa Mnk-2 humana comprende los resto.

7. 385.

4. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cinasa Mnk-2 humana comprende al dominio de cinasa.

5. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un mutante de 15 cinasa Mnk-2 humana.

6. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 5, que es un mutante D228G de cinasa Mnk-2 humana.

7. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en complejo con un ligando, sustrato y/o inhibidor de la misma.

8. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 7, donde el inhibidor estaurosporina.

9. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la cinasa Mnk-2 humana está en una forma inactiva.

10. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde es un cristal individual.

11. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una estructura tridimensional definida por las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 1, ilustradas en la Figura 14, Tabla 1a ilustradas en la Figura 15 o Tabla 3 ilustradas en la Figura 17.

12. Cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene una estructura cristalina de cinasa Mnk-2 humana inactiva.

13. Un método para producir una preparación de cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las etapas de:

(i) expresar la cinasa Mnk-2 humana en células,

(ii) lisar las células para recuperar una preparación de cinasa Mnk-2 en bruto,

(iii) purificar la preparación de cinasa Mnk-2 en bruto,

(iv) cristalizar la cinasa Mnk-2 purificada, donde los cristales se crecen por difusión de vapor. 45

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la cinasa Mnk-2 humana es mutante D228G de cinasa Mnk-2 humana.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, donde la cinasa Mnk-2 se expresa como una proteína de fusión en E. coli.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde la cinasa Mnk-2 se purifica usando una columna que se une a un marcador de fusión.

17. Uso de la cinasa Mnk-2 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 u obtenible de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para el diseño, identificación y/o preparación de ligandos de cinasa Mnk-2, donde el ligando tiene una estructura tridimensional que es complementaria a un sitio de inserción de cinasa Mnk-2 humana y en particular, interactúa con al menos uno de los aminoácidos Asp 226, Phe 227 y Asp 228, y/o al menos con uno de los restos de cisteína de un sitio de unión a cinc.

18. Un método de análisis por ordenador de la interacción de un compuesto con cinasa Mnk-2 humana que comprende proporcionar una representación tridimensional de cinasa Mnk-2 humana que comprende proporcionar las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 1 ilustradas en la Figura 14, la Tabla 1a ilustradas en la Figura 15 o la Tabla 3 ilustradas en la Figura 17 y usar dichas coordenadas estructurales para construir una representación 65 tridimensional de la estructura cristalina, proporcionar una representación tridimensional de dicho compuesto y ajustar la representación tridimensional de dicho compuesto a la representación tridimensional de cinasa Mnk-2

humana.

19. Un método para determinar la estructura cristalina de una proteína, en particular, una cinasa, proporcionando las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 1 ilustrada en la Figura 14, la Tabla 1a ilustradas en la Figura 15 o la Tabla 3 ilustradas en la Figura 17 y usar dichas coordenadas estructurales para reemplazo molecular para proporcionar una estructura cristalina de dicha proteína.

20. Cinasa Mnk-1 humana cristalina, que tiene un grupo espaciador P43212 y dimensiones de celda unitaria de a = 93, 5Ã, b= 93, 5Ãy c =175, 2 Ã.

21. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 20, donde la cinasa Mnk-1 humana comprende los restos 37 a 341.

22. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, donde la cinasa Mnk-1 humana 15 comprende al dominio de cinasa.

23. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 22, que es un mutante de cinasa Mnk1 humana.

24. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 en complejo con un ligando, sustrato y/o inhibidor de la misma.

25. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde la cinasa

Mnk-1 humana está en una forma inactiva. 25

26. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, donde es un cristal individual.

27. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, que tiene una estructura tridimensional definida por las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 2, ilustradas en la Figura

16.

28. Cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con la reivindicación 27, que tiene una estructura cristalina de cinasa Mnk-1 humana inactiva. 35

29. Un método para producir una preparación de cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, que comprende las etapas de:

(i) expresar la cinasa Mnk-1 humana en células,

(ii) lisar las células para recuperar una preparación de cinasa Mnk-1 en bruto,

(iii) purificar la preparación de cinasa Mnk-1 en bruto,

(iv) cristalizar la cinasa Mnk-1 purificada, donde los cristales se crecen por difusión de vapor.

30. El método de acuerdo a la reivindicación 29, donde la cinasa Mnk-1 humana es un fragmento de cinasa Mnk-1 45 que tiene los restos de aminoácidos 37 a 341.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 29 o 30, donde la cinasa Mnk-1 se expresa como una proteína de fusión en E. coli.

32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde la cinasa Mnk-1 se purifica usando una columna que se une a un marcador de fusión.

33. Uso de la cinasa Mnk-1 humana cristalina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28 u obtenible de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 para el diseño, identificación y/o preparación de ligandos

de cinasa Mnk-1, donde el ligando tiene una estructura tridimensional que es complementaria a un sitio de inserción de cinasa Mnk-1 humana y en particular, interactúa con al menos uno de los aminoácidos Arg90 o Arg93.

34. Un método de análisis por ordenador de la interacción de un compuesto con cinasa Mnk-1 humana que comprende proporcionar una representación tridimensional de cinasa Mnk-1 humana que comprende proporcionar las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 2 ilustradas en la Figura 16 y usar dichas coordenadas estructurales para construir una representación tridimensional de la estructura cristalina, proporcionar una representación tridimensional de dicho compuesto y ajustar la representación tridimensional de dicho compuesto a la representación tridimensional de cinasa Mnk-1 humana.

35. Un método para determinar la estructura cristalina de una proteína, en particular, una cinasa, proporcionando las coordenadas estructurales mostradas en la Tabla 2 ilustrada en la Figura 16, y usar dichas coordenadas

estructurales para reemplazo molecular para proporcionar una estructura cristalina para dicha proteína.