Procedimiento de estabilización de biomoléculas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran dichas biomoléculas.

Es de aplicación a un amplio número de biomoléculas tales como ATP o NADH y permite la utilización de las mismas en procedimientos analíticos, clínicos o médicos que se vayan a llevar a cabo en condiciones no adecuadas para el mantenimiento de su estabilidad.

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN La presente invención se encuadra en el ámbito del sector farmacéutico y de la biotecnología. El procedimiento de estabilización de biomoléculas objeto de la presente invención pretende dar solución al problema técnico que representa el hecho de que ciertas moléculas orgánicas necesarias para que la maquinaria celular pueda seguir funcionando

(como ATP, NADH, ARN, Y muchas proteínas y enzimas) son muy inestables, sobre todo cuando las condiciones a que se ven expuestas son extremas, por ejemplo pero no exclusivamente, por aumentos de temperatura.

Para la utilización de estas moléculas en ensayos o reacciones y para su empleo clínico,

esas biomoléculas han de mantenerse en condiciones estables hasta su utilización. Además, su almacenamiento o transporte no siempre es posible hacerlo en frío y en muchas ocasiones algunos reactivos que contienen algunas de estas biomoléculas han de ser transportados o mantenidos en condiciones inadecuadas para el mantenimiento de su estabilidad. La tecnología propuesta presenta la posibilidad de aumentar significativamente la estabilidad de biomoléculas lo que tiene aplicaciones prácticas para su utilización en reacciones o ensayos enzimáticos o analíticos, en procedimientos clínicos o médicos, o cualquier otra utilización.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las células vivas se componen de un amplio número de moléculas orgánicas. La gran mayoría de ellas son propias de esas células por lo que se suelen denominar biomoléculas. Aunque las células parecen perfectamente estables, se sabe que un gran número de biomoléculas son relativamente inestables en solución dependiendo de las condiciones en las que se mantengan (Str y er L, Berg JM, Tymoczko JL. 2002. Bioquímica. Ed. Reverté,

Barcelona) . Por ejemplo, la gran mayoría de biomoléculas no resisten exposición a temperaturas relativamente elevadas. Como ejemplos típicos de biomoléculas inestables podemos eitar, entre otras, el ATP (adenosin trifosfato) , NAD (nieotinamida adenina dinucleótido) y NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) , ARN (ácido ribonucleico) y un largo número de proteínas (Str y er et al. 2002) .

A pesar de la inestabilidad de muchas moléculas biológicas, hoy en día sabemos que existen microorganismos que necesitan temperaturas elevadas, incluso alrededor de los 100º C, para crecer y desarrollarse (Grogan, DW. 1998. Hyperthermophiles and the problem 01 DNA instability. Mol Microbiol. 28: 1043-1049; Vieille C, Zeikus GJ . 2001 . Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms of thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43) . Estos microorganismos termófilos, sin embargo, utilizan las mismas biomoléculas que cualquier otro ser vivo (Stetter, KO. 1999. Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett 452: 22-25; Daniel, RM, DA Cowan. 2000. Biomolecular stability and life at high temperatures. Cell Mol Life Sci. 57: 250-264) . Un problema fundamental es como moléculas tan lábiles como el ATP, que es la molécula energética por excelencia en las células, pueden permitir que continúe la vida de esas células a temperaturas elevadas. El ATP, por ejemplo, se descompone un 60% al exponerse 1 h a 95º C y el NAD más del 95% en dichas condiciones (Daniel and Cowan , 2000) en solución a pH 7.

Existen un sinfín de casos en los que distintas biomoléculas de uso comercial se exponen a elevadas temperaturas u otras condiciones adversas para su estabilidad. En la actualidad, prácticamente todas las biomoléculas inestables se transportan y almacenan bajo refrigeración. Sin embargo, existen muchas ocasiones que no es posible mantenerlas refrigeradas o un sistema de refrigeración adecuado no está disponible. El caso más típico sería el envio de biomoléculas para análisis o procedimientos médicos o clínicos a países del tercer mundo, o el mantenimiento de reactivos para análisis en condiciones de calor intenso como pueden ser ambulancias o coches de policía en épocas veraniegas en España. El problema es conseguir mantener biomoléculas estables en cualquier condición ambiental sin necesidad de sistemas caros de congelación.

Se discuten a continuación documentos encontrados que reflejan cual es el estado de la técnica:

CA2568714A1: A biomolecule-containing formulation of increase stability Esta patente se centra en administrar biomoléculas, glicoproteínas (interferon) en este caso, en una solución relativamente compleja que le confiere mayor estabilidad dentro de un fluido no acuoso. Los interferones son especialmente inestables y han de estabilizarse durante su administración. La solución que proponen incluye la desecación de la biomolécula (por ejemplo, por liofilización) y suspensión de la particula desecada resultante en un fluido no

acuoso hidrofóbico. La particula desecada incluye la biomolécula (interferon) un tampón, un surfactante, y uno o más estabilizadores que pueden ser un carbohidrato, un antioxidante y un aminoacido. La temperatura para las que se propone es de 37º C o ligeramente superior. El procedimiento objeto de la presente invención es mucho más sencillo, es aplicable a cualquier biomolécula (no sólo glicoproteinas) y puede emplearse para el mantenimiento a largo plazo de biomoléculas a elevadas temperaturas (muy superiores a 37º C) , no únicamente durante su administración. No se requiere la inclusión de la biomolécula como una suspensión de partículas secas.

EP1449523A1 : Composition and method for stable injectable liquids Esta patente se basa en la estabilización de vacunas para su transporte sin refrigeración . La vacuna o material bioactivo se estabiliza inmovilizándolo en una substancia cristalina (glassy; por ejemplo, cristales de azúcares) , de la cual las pequeñas partículas siempre se suspenden en uno o más fluorocarbonos líquidos en los que las partículas son insolubles. A efectos de lo buscado en este documento, lo que se utiliza es la elevada densidad de los fluorocarbonos para separarlos en distintas fases de substancias tampón que disolverían las partículas cuando necesiten ser utilizadas. Un inconveniente de este procedimiento es que los fluorocarbonos están muy regulados por su riesgo ambiental.

Frente a lo divulgado en este documento, el procedimiento de la invención no contempla necesariamente el empleo de fluorocarbonos sino que se basa en aumentar la viscosidad como un método sencillo para estabilizar biomoléculas sometidas a situaciones inadecuadas para su almacenamiento, transporte º manipulación.

EP2489736A1: Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe Se basa en el empleo de amidas para la estabilización de biomoléculas (sondas biológicas) . Está dirigida al mantenimiento de diversos tipos de biomoléculas, entre ellas ácidos nucleicos y proteínas que pueden estar refrigeradas o no. Opcionalmente se emplean, además de las amidas, diversos compuestos como alcoholes, disolventes, tampones, sustancias osmóticamente activas, quelatantes u otras, consiguiéndose estabilizar las biomoléculas en un rango de temperaturas comprendido entre -80 y 80º C. El procedimiento de invención propuesto en el presente caso no utiliza amidas y propone un método sencillo de estabilizar biomoléculas aumentando la viscosidad de la solución que contiene dichas biomoléculas.

US2012308987A1: Matrices and media lor storage and stabilization 01 biomolecules Esta invención se basa en el empleo de compuestos, principalmente inorgánicos y solubles en agua, que funcionan como antioxidantes y permiten la estabilización y almacenaje de biomoléculas en estado seco (dr y -state) . En ciertas composiciones emplean lo que denominan plastificador que es un compuesto que facilita el almacenamiento de la matriz en estado seco. Estos plastificadores mejoran las propiedades de la matriz (por ejemplo, su flexibilidad) y entre muchos de los posibles plastificadores que mencionan se encuentra el etilen glicol. Se menciona que el plastificador no interfiere con la estabilidad química o física de las biomoléculas almacenadas.

La principal diferencia con respecto al procedimiento objeto de la presente invención es que en esta patente se requiere que se seque la biomolécula, su uso en seco. Además la formulación es más compleja y se basa en el empleo de compuestos inorgánicos solubles en agua, antioxidantes y una larga lista de otros posibles compuestos (plastificadores) para mejorar el funcionamiento de la formula. La formula puede incluir inhibidores de ARNasas, ADN, ARN, aminoácidos, entre otros. La formulación es altamente compleja.

W00243750A2: Method for stabilizing biomolecules in liquid formulations. Esta tecnología se centra en el empleo de solventes... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran 5 dichas biomoléculas.

2. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio en el cual se encuentran las biomolécuas es acuoso.

3. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el mantenimiento de la viscosidad del medio acuoso en el cual se encuentran las biomoléculas se lleva a cabo añadiendo modificadores de la viscosidad seleccionados entre, etilenglicol, ectoína, almidón, ficoll, sacarosa, maltosa, trehalosa, gelatina, albúmina, caseína o lisozima.

4. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 3, caracterizado porque el modificador de la viscosidad es etilenglicol.

5. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 4,

caracterizado porque el etilenglicol se añade al medio acuoso a una concentración comprendida entre el 20% yel 70%, preferentemente al 50%.

6. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según las reivindicaciones 1 a 5,

caracterizado porque las biomoléculas a estabilizar se seleccionan entre, ARN, ATP, NAO, 25 NAOH, NAOP, otros factores enzimáticos y enzimas.

7. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 6, caracterizado porque la biomolécula estabilizada es adenosintrifosfato (ATP) .

8. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 7, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del ATP es una solución acuosa de etilenglicol.

9. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 8, caracterizado porque la solución acuosa de etilenglicol es una disolución al 50% en tampón fosfato al 0.1 M Y pH = 7.3.

10. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque la molécula de ATP se estabiliza en dicho medio en un intervalo de temperaturas comprendido entre 25 y 90º C.

. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 6,

caracterizado porque la biomolécula estabilizada es nicotinamida adenín dinucleotido (NADH ) .

12. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 11,

caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución 15 acuosa de etillénglicol.

13. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 12, caracterizado porque la solución acuosa de etilenglicol es una disolución al 50% en tampón fosfato al 0.1 M Y pH = 7.3.

14. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 11, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución acuosa de ectoína 15. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 14, caracterizado porque la solución acuosa de ectoína es una disolución a una concentración de 0.45 g/mI.