Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas.

Un ácido nucleico, codificando una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según se presenta en SEQ ID NO:

1;

donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D ;

y donde la secuencia tiene mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) F93W, N97R y H144K,

(ii) H144C y N92C,

(iii) F180Q, H144C y N92C,

(iv) V108H,

(v) S65C y S 186C,

(vi) H22K, F180Q, H144C y N92C;

donde la posición de los aminoácidos sustituidos está numerada desde el aminoácido después de la señal y la prosecuencia.

Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas

CAMPO

Esta publicación afecta a las enzimas modificadas con una estabilidad aumentada en entornos duros 5 industriales, como una temperatura y/o un pH aumentado.

ANTECEDENTES

Las xilanasas se han descubierto en al menos cien organismos diferentes. Las xilanasas son glicosil hidrolasas que hidrolizan cadenas de xilopiranósido con uniones β-1, 4. Dentro de la clasificación basada en secuencia de las familias glicosil hidrolasas establecidas por Henrissat y Bairoch (1993) , la mayoría de xilanasas 10 se encuentran en las familias 10 y 11. Las características comunes para los miembros de la familia 11 incluyen una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento (Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994) . Las familias se han agrupado ahora, basándose en similitudes de estructura, en Clanes (Henrissat and Davies, 1995) . La familia 11 de glicosil hidrolasas, que son principalmente xilanasas, residen en el Clan C junto con la familia 12 de enzimas, conocidas todas por ser

celulasas.

Las xilanasas pueden utilizarse a menudo para aplicaciones importantes como el blanqueamiento de la pulpa, la modificación de fibras textiles y en la alimentación animal (p.ej., las xilanasas pueden ayudar la digestión de un animal, Prade, 1996) . Las xilanasas son útiles para la producción de comida para seres humanos también. Por ejemplo, la xilanasa mejora las propiedades de la masa de pan y la calidad del pan. Las xilanasas también pueden ayudar en el proceso de elaboración de cerveza mejorando la filtrabilidad de las cervezas que contienen xilano. Las xilanasas pueden emplearse en la descomposición de la materia vegetativa incluyendo la eliminación/el uso de residuos agrícolas y de residuos que resultan del procesamiento de los productos agrícolas, incluyendo la producción de fueles u otros productos/materiales de base biológica a partir de la biomasa.

Sin embargo, a menudo las condiciones extremas en estas aplicaciones, como una temperatura y/o pH altos, etc, hacen que las xilanasas rindan con menos efectividad que bajo condiciones normales. Durante el blanqueo de pulpa, por ejemplo, el material que viene de una fase de lavado alcalino puede tener una temperatura alta, a veces mayor a 80º C y un pH alto, como un pH más alto de 10. Ya que la mayoría de xilanasas no funcionan bien bajo esas condiciones, la pulpa debe enfriarse y el pH alcalino neutralizarse antes de que la xilanasa normal pueda funcionar. Tomando algunos de estos pasos en cuenta, el proceso puede volverse más caro ya que debe alterarse para adaptar la xilanasa.

En otro ejemplo, las xilanasas también son útiles en las aplicaciones de alimentos para animales. Ahí, las enzimas pueden enfrentarse a condiciones de temperaturas altas durante un periodo corto de tiempo (p.ej. -0, 5 – 5 min a 95º C o más) durante la preparación de la alimentación. La inactivación de la enzima puede ocurrir bajo estas condiciones de temperatura y las enzimas resultan inservibles cuando se necesitan a una temperatura más baja como, por ejemplo, ~37 º C.

Se han descubierto xilanasas con cualidades mejoradas. Varias xilanasas termoestables, alcalofilas y acidofilas se han descubierto y clonado a partir de organismos termófilos (Bodie et al., 1995; Fukunaga et al., 1998) . Sin embargo, suele resultar difícil producir las enzimas en cantidades económicamente eficientes. T. 40 reesei, por otra parte, produce xilanasas, que no son termoestables como las xilanasas de los organismos termófilos. T. reesei es conocido por producir xilanasas diferentes de las que las xilanasas I y II (Xynl y Xynll, respectivamente) son las mejor caracterizadas (Tenkanen et al., 1992) . XynI tiene un tamaño de 19 kDa, un pl de 5, 5 y un pH entre 3 y 4. Xynll tiene un tamaño de 20 kDa, un pl de 9, 0 y un pH óptimo de 5, 0-5, 5 (Törrönen y Rouvinen, 1995) . Estas xilanasas presentan un perfil de pH, especificidad y actividad específica favorables en 45 una cantidad de aplicaciones y puede producirse de manera económica en procesos de producción a gran escala.

Se han realizado esfuerzos para producir una xilanasa con cualidades favorables. Por ejemplo, algunos han intentado mejorar la estabilidad de la xilanasa Bacillus circulans añadiendo puentes de disulfuro que unen el N-término de la proteína al C-término y la parte N-terminal de la hélice-α a la hebra-β cercana (Wakarchuk et al., 50 1994) . Además, Campbell et al. (1995) modificó la xilanasa Bacillus circulans mediante enlaces inter e intra moleculares de disulfuro con tal de aumentar la termoestabilidad. De manera similar, la estabilidad de la T. reesei xilanasa II ha sido mejorada al cambiar la región N-terminal a una parte respectiva de una xilanasa termófila (Sung et al., 1998) . Además de la termoestabilidad mejorada, el intervalo de actividad de la enzima se amplió

para incluir un pH alcalino. Las mutaciones de punto único también se han utilizado para aumentar la estabilidad de la xilanasa Bacillus pumilus (Arase et al., 1993) .

Al comparar las estructuras de las enzimas termófilas y mesófilas se ha obtenido mucha información (Vogt et al., 1997) . El análisis estructural de las xilanasas termófilas también ha dado información sobre los 5 factores que influyen la termoestabilidad de la xilanasas (Gruber et al., 1998; Harris et al., 1997) .

Kimura T. et al. (Bioscience, Biotechnology, Biochemistr y , Japan Society for Bioscience and Agrochemistr y , TOKYO, JAPÓN, vol. 64, núm. 6, 1 Junio 2000, páginas 1230-123) publica la purificación, caracterización y clonación molecular de una xilanasa acidófila a partir de Penicillium sp.40.

WO02/38746 publica la secuencia de una xilanasa alcalófila a partir de Aspergillus kawachii.

Sin embargo, actualmente, existe una necesidad de enzimas, especialmente xilanasas con propiedades mejoradas en condiciones industriales.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente publicación hace referencia a enzimas modificadas. Específicamente, la invención hace referencia a enzimas modificadas con un funcionamiento mejorado en condiciones extremas de pH y 15 temperatura.

En un primer aspecto, la publicación describe una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácido según se establece en la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 20 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. Preferiblemente, la sustitución se selecciona del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. Preferiblemente, la xilanasa modificada tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Además, preferiblemente, la xilanasa modificada muestra una termofilicidad, alcalofilicidad o una combinación de las mismas mejorada, en comparación con un tipo silvestre de xilanasa. [0014] En un segundo aspecto, la publicación describe una enzima modificada, la enzima modificada comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia establecida en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10 , 11, 16, 19, 22,

26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a la posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. [0015] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una glicosilhidrolasa del Clan C comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia establecida en SEQ ID NO:1 la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a la posición seleccionada del grupo que consiste... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico, codificando una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según se presenta en SEQ ID NO:1;

donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D ;

y donde la secuencia tiene mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) F93W, N97R y H144K,

(ii) H144C y N92C,

(iii) F180Q, H144C y N92C,

(iv) V108H, 10 (v) S65C y S 186C,

(vi) H22K, F180Q, H144C y N92C;

donde la posición de los aminoácidos sustituidos está numerada desde el aminoácido después de la señal y la prosecuencia.

2. Una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácido según se presenta en SEQ ID NO:1;

donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D;

y donde la secuencia comporta las mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) F93W, N97R y H144K, 20 (ii) H144C y N92C,

(iii) F180Q, H144C y N92C,

(iv) V108H,

(v) S65C y S 186C,

(vi) H22K, F180Q, H144C y N92C;

donde la posición del aminoácido sustituido está numerada a partir del aminoácido después de la señal y la prosecuencia.

Figura 1