Enzimas lecitina-colesteros acitransferasa modificadas.

Polinucleotido que codifica una proteina lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada,

en el que la proteina LCAT modificada comprende una modificacion en la secuencia de aminoacidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2, y la modificación consiste en una sustitucion en el residuo de aminoacido 031 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, 031F, 031V, C31W, C31Y, 031R y 031H.

Enzimas lecitina-colesterol aciltransferasa modificadas Campo de la Invención

Esta invención se refiere en general al campo de la medicina y, más específicamente, a composiciones y a métodos para tratar cardiopatía coronaria, aterosclerosis, trastornos inflamatorios y trastornos asociados con trombosis.

Antecedentes de la invención

Más de 50 millones de estadounidenses tienen problemas cardiovasculares, y muchos otros países se enfrentan a tasas altas y crecientes de enfermedad cardiovascular. Es la causa número uno de muerte y discapacidad en los Estados Unidos y la mayoría de los países europeos. En el momento en el que se detectan problemas cardiacos, la causa subyacente, la aterosclerosis, habitualmente está bastante avanzada, habiendo progresado durante décadas.

La aterosclerosis es una enfermedad compleja poligénica de mamíferos caracterizada por los depósitos o placas de lípidos y otros derivados sanguíneos en las paredes arteriales (aorta, arterias coronarias y carótida). Estas placas pueden estar calcificadas en un mayor o menor grado según la progresión del proceso. También están asociadas con la acumulación de depósitos grasos que consisten principalmente en ésteres de colesterol en las arterias. El colesterol se acumula en las células espumosas de la pared arterial, estrechando de ese modo la luz y disminuyendo el flujo de sangre. Esto va acompañado por un engrosamiento de la pared arterial, con hipertrofia del músculo liso, la aparición de células espumosas y la acumulación del tejido fibroso. Por tanto, la hipercolesterolemia puede dar como resultado patologías cardiovasculares muy graves tales como infarto, enfermedad vascular periférica, accidente cerebrovascular, muerte súbita, descompensación cardiaca, accidentes vasculares cerebrales y similares.

El colesterol se porta en la sangre por diversas lipoproteínas incluyendo las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL). Las VLDL se sintetizan en el hígado y se convierten en LDL en la sangre, lo que hace posible suministrar colesterol a los tejidos periféricos. En cambio, las HDL capturan moléculas de colesterol de los tejidos periféricos y las transportan al hígado en el que se convierten en ácidos biliares y se excretan. El desarrollo de aterosclerosis y el riesgo de cardiopatía coronaria (CPC) se correlacionan de manera inversa con los niveles de HDL en el suero. Gordon etal. (1989) N. Engl. J. Med. 321: 1311; Goldbourt et al. (1997) Thromb Vasc. Biol. 17: 107. Se producen a menudo bajos niveles de colesterol HDL en el contexto de obesidad central, diabetes y otras características del síndrome metabólico. Goldbourt et al., citado anteriormente. Se ha sugerido que bajos niveles de colesterol HDL están asociados con un aumento del riesgo de CPC, mientras que altas concentraciones de HDL tienen un efecto protector frente al desarrollo de aterosclerosis prematura. Gordon et al. (1986) Circulation 74: 1217. Estudios demostraron que el riesgo de desarrollo de aterosclerosis clínica en hombres desciende un 2-3% con cada aumento de 1 mg/dl en la concentración de HDL en plasma. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321: 1311. Se ha establecido que pueden reducirse las concentraciones de colesterol LDL mediante tratamiento con estatinas, inhibidores de la enzima de biosíntesis de colesterol 3-hidroxil-3-metilglutaril coenzima A reductasa y de ese modo este tratamiento se ha usado como enfoque satisfactorio para reducir el riesgo de aterosclerosis cuando la indicación primaria es un nivel de LDL alto. Sin embargo, sigue estando poco claro si las estatinas son beneficiosas para pacientes cuya anomalía lipídica primaria es colesterol HDL bajo.

La lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) es una enzima que cataliza la esterificación de colesterol libre mediante la transferencia de un grupo acilo de la fosfatidilcolina sobre el grupo 3-hidroxllo del colesterol, formando éster de colesterilo y lisofosfatidilcolina. McLean et al. (1986) Proc. Nati. Acad Sci. 83: 2335 y McLean et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14(23): 9397. Se sintetiza LCAT en el hígado y se secreta al plasma, donde se combina con HDL, denominadas lipoproteínas antiaterogénicas. Estas partículas de HDL tienen la capacidad de aceptar el colesterol en exceso, que entonces se esterifica mediante LCAT en las partículas de HDL. Las moléculas de éster de colesterilo en las partículas de HDL o bien se transportan al hígado directamente a través del receptor SR-BI, o bien se transfieren a lipoproteínas que contienen apoB, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL, mediada por CETP, y entonces se transportan al hígado a través de la ruta del receptor de LDL. Este mecanismo, denominado transporte de colesterol inverso (Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:155), permite la eliminación del colesterol en exceso del cuerpo, y por tanto está implicado en la prevención de la aterogénesis. LCAT desempeña un papel clave en este proceso creando un gradiente de colesterol libre entre las membranas plasmáticas y las lipoproteínas circulantes.

Wang etal. (2000). Biochim. Biophys. Acta 1488 (3), 268-277 tratan la importancia de los grupos sulfhidrilo libres de LCAT para determinar su sensibilidad a la inactivación oxidativa.

Esta invención proporciona proteínas LCAT modificadas con estabilidad y/o actividad enzimática aumentada y métodos para el tratamiento de cardiopatía coronaria, aterosclerosis, trastornos inflamatorios y trastornos asociados con trombosis usando estas proteinas LCAT modificadas.

Sumario de la invención

La invención se refiere a:

1. Un polinucleótido que codifica para una proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en el que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2, y la modificación consiste en una sustitución en

el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H.

2. Un polinucleótido que codifica para una proteina lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en el que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 tal como se expone en la figura 2, y la modificación consiste en una sustitución en

el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H, y una sustitución adicional en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, V28, P29, G30, L32, G33 y N34.

3. El polinucleótido según 2, en el que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1A, L4F, N5E, N5Q, N5D, N5A, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, G30A, G30I, L32A, L32I, L32M, L32F,

L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S y N34R.

4. El polinucleótido según 2, en el que la sustitución en C31 es una sustitución C31Y y la sustitución adicional es en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, L32 y N34.

5. El polinucleótido según 4, en el que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1S, F1W, L4F, L4M, N5D, L4K, N34S, L32F y L32H.

6. El polinucleótido según 5, en el que la sustitución adicional es una sustitución L4F.

7. El polinucleótido según 5, en el que la sustitución adicional es una sustitución N5D.

8. El polinucleótido según 4, en el que la sustitución adicional es una sustitución en N5.

9. El polinucleótido según 4, en el que la sustitución adicional es una sustitución en L4.

10. El polinucleótido según cualquiera de 1-9, en el que el polinucleótido codifica además para un vehículo.

11. El polinucleótido según 10, en el que el vehículo es un dominio constante (Fe) de inmunoglobulina.

12. El polinucleótido según 11, en el que el dominio Fe es un dominio de IgG.

13. El polinucleótido según 12, en el que el dominio de IgG es un dominio de lgG1 humana.

14. El polinucleótido según cualquiera de 1-13, en el que el polinucleótido es una molécula de ADN.

Se dan a conocer en el presente documento proteínas LCAT modificadas que comprenden una sustitución de 30 aminoácido en una secuencia de aminoácidos de proteína LCAT silvestre. En una realización, la proteína LCAT modificada codificada es más activa enzimáticamente que la proteína LCAT silvestre de la que se deriva la proteína LCAT modificada. En otra realización,... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido que codifica una proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en el que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2, y la modificación consiste en

una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M,

C31F, C31V, C31W, C31 Y, C31R y C31H.

2. Polinucleótido que codifica para una proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en el que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2, y la modificación

consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I,

C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H, y una sustitución adicional en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1 L4, N5, V28, P29, G30, L32, <333 y N34.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2, en el que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1A, L4F, N5E, N5Q, N5D, N5A, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, G30A,

G30I, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F,

G33S, G33H, N34A, N34C, N34S y N34R.

4. Polinucleótido según la reivindicación 2, en el que la sustitución en C31 es una sustitución C31Y y la sustitución adicional es en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, L32 y N34.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la sustitución adicional se selecciona del grupo que

consiste en F1S, F1W, L4F, L4M, N5D, L4K, N34S, L32F y L32H.

6. Polinucleótido según la reivindicación 5, en el que la sustitución adicional es una sustitución L4F.

7. Polinucleótido según la reivindicación 5, en el que la sustitución adicional es una sustitución N5D.

8. Polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la sustitución adicional es una sustitución en N5.

9. Polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la sustitución adicional es una sustitución en L4.

10. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el polinucleótido codifica además para un vehículo.

11. Polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el vehículo es un dominio constante (Fe) de inmunoglobulina.

12. Polinucleótido según la reivindicación 11, en el que el dominio Fe es un dominio de IgG.

13. Polinucleótido según la reivindicación 12, en el que el dominio de IgG es un dominio de lgG1 humana.

14. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el polinucleótido es una molécula de ADN.