Enzimas de procesamiento fusionadas a marcadores de proteínas básicas.

Enzima de procesamiento que comprende un marcador fijado en el extremo N-terminal,

en donde el marcador consiste en una secuencia peptídica procedente de la familia L9 de proteínas ribosómicas procedentes de bacterias termófilas, en donde el marcador tiene de 15 a 250 aminoácidos, en donde el marcador comprende al menos 15% de residuos de aminoácidos básicos, Lys y Arg, y en donde el marcador tiene un pI superior a 9.

Enzimas de procesamiento fusionadas a marcadores de proteínas básicas Campo de la invención

La presente invención se refiere a enzimas de procesamiento novedosas que comprenden un marcador proteico alcalino obtenido a partir de bacterias termofílicas.

Antecedentes de la invención

La expresión de proteínas recombinantes en células hospedadoras microbianas se utiliza extensamente para la producción industrial de proteínas terapéuticas humanas. Una pareja de fusión puede estar fijada en el extremo N- terminal (o C-terminal) de la proteína diana y sirve para aumentar el nivel de expresión, la solubilidad o el plegamien- to correcto de la proteína diana y para facilitar la purificación durante el procesamiento aguas abajo. La eliminación de la pareja de fusión de la proteína diana es necesaria principalmente para conservar la actividad biológica de la proteína diana. El procesamiento de la proteína de fusión se puede realizar o bien después de la expresión o después de una o varias etapas de purificación ¡nidal, utilizando proteasas adecuadas capaces de escindir la pareja de fusión para liberar la proteína diana. La proteína diana recombinante con o sin pareja de fusión también puede ser que sea necesario modificarla después de la traducción para obtener ciertas características biológicas, usando una o varias etapas enzimáticas. Tal modificación incluye la eliminación de glicosilaciones no deseadas con azúcares de tipo mañosa, fucosa o xilosa o la introducción de glicosilaciones. Las modificaciones también pueden incluir desami- daciones, amidaciones, metilaciones, fosforilaciones, desfosforilaciones, sulfataciones, aceraciones o transamina- ciones. Para disminuir el coste de las etapas de procesamiento aguas abajo es fundamental que estas enzimas de procesamiento tengan un bajo coste de producción, por ejemplo, que se puedan expresar en grandes cantidades y purificar con un número reducido de etapas cromatográficas. Además, es deseable que las enzimas de procesamiento utilizadas para la escisión de proteínas de fusión se puedan eliminar fácilmente después del procesamiento de la proteína diana. También puede ser ventajoso que las enzimas de procesamiento se puedan inmovilizar en columnas de purificación.

Gráslund et al. (J. Biotechnol. 96 (22) 93-12) describen una proteasa de fusión que comprende un controlador de la purificación Zbasic fusionado con el extremo N-terminal de una polimerasa de ADN Klenow y con una proteasa 3C. El dominio Zbasic es un agrupamiento de tres hélices antiparalelas de 58 aminoácidos, desarrollado a partir de uno de los cinco dominios que constituyen la proteína A de estafilococos.

B¡ et al. (Prot. Expr. and Purif. 47 (26) 234-24) describen una proteína de fusión de NTL9, una secuencia de escisión del Factor Xa y un fragmento de 21 aminoácidos HP21 del subdominio helicoidal de vilina en la parte anterior (HP36), cuya proteína de fusión es útil para la purificación de proteínas pequeñas.

El documento WO 26/18826 responde a las condiciones del Art. 54(3) y describe proteínas ribosómicas básicas como marcadores para la purificación.

La presente invención proporciona nuevas enzimas de procesamiento que son muy adecuadas para la modificación de proteínas diana, incluyendo la escisión de parejas de fusión de una proteína de fusión. Además, las nuevas enzimas de procesamiento se pueden separar fácilmente de la proteína diana después de la etapa de procesamiento.

Compendio de la invención

En un aspecto, la invención proporciona enzimas de procesamiento que comprenden un marcador fijado en el extremo N-terminal, en donde el marcador consiste en una secuencia peptídica procedente de la familia L9 de proteínas ribosómicas procedentes de bacterias termófilas, en donde el marcador tiene de 15 a 25 aminoácidos, en donde el marcador comprende al menos 15% de residuos de aminoácidos básicos, Lys y Arg, y en donde el marcador tiene un pl superior a 9.

En una realización, el marcador se fija a la proteína de procesamiento a través de una secuencia enlazadora.

En otra realización, el marcador no comprende residuos de cisterna.

En otra realización, el marcador comprende de 5 a 25 o de 75 a 2, de 1 a 25 o de 1 a 2 residuos de aminoácidos.

En otra realización, el marcador comprende de 2 a 5% de residuos de aminoácidos básicos.

En otra realización, el marcador se selecciona entre el grupo de secuencias peptídicas que consiste en MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREE SEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEY SLEVSLPGGVKDTIKlRVEREE{SEQ ID NO:1);

MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKR LAERKAEAERLKElLENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITiDPKRLALEKPIKEL GEYVLTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQ ID NO: 41);

mkviflkdvkgkgkkgeikdvadgyannflfkqglaieatpanikaleaqkqkeqrqaaeel

AN AK KLKEE LEKLTVEIP AK AG ÉGGRLFGSITSKQIAEA LQAQ HGLK LDKR KIELA DAIRSLGY TNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(SEQ ID NO: 42) y

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En otra realización, la enzima de procesamiento se selecciona entre oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, Nasas, isomerasas y ligasas.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una estructura artificial de ácido nucleico que codifica la enzima de procesamiento de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una enzima de procesamiento de acuerdo con la invención, que comprende;

i) la expresión de la enzima de procesamiento de acuerdo con la invención,

¡i) cargar dicha enzima de procesamiento expresada sobre una columna de intercambio catiónico, y

iii) eluir dicha enzima de procesamiento con un eluyente adecuado.

En una realización del método, la enzima de procesamiento es una proteasa seleccionada entre el grupo que consiste en proteasa HRV14 3C, proteasa HAV18 3C, proteasa TEV y RHDV 3C.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para modificar un precursor de proteína diana que comprende las etapas de hacer reaccionar una enzima de procesamiento marcada en el extremo N-terminal de acuerdo con la invención, con el precursor de la proteína diana y separar la proteína diana de la enzima de procesamiento.

En una realización de este método, la enzima de procesamiento marcada en el extremo N-terminal y el precursor de la proteína diana se coexpresan en un hospedador adecuado para permitir el aislamiento de la proteína diana después de la expresión.

En otra realización de este método, dicho hospedador se selecciona a partir de las cepas de Bacillus, Streptomyces y Escherichia coli.

El marcador facilitará la expresión de una enzima de procesamiento marcada soluble con un rendimiento elevado. El marcador también permitirá una pureza elevada después de una etapa de purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico aislada, así como una eliminación fácil de la enzima de procesamiento marcada después del procesamiento del precursor de la proteína diana. Los marcadores también permiten el procesamiento en la columna empleando una matriz de cromatografía de intercambio catiónico como ¡nmovlllzador para la enzima de procesamiento marcada.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1: describe un mapa vectorial del vector obtenido a partir de pET 11 a que codifica la enzima de procesamiento pACSH238 que consiste en SEQ ID NO: 1 como marcador N-terminal para la purificación, SEQ ID NO: 28 como enlazador y SEQ ID NO: 35 como la proteasa HRV14 3C. Los sitios de clonación Ndel, Xhol y BamHI se Indican, así como la secuencia que codifica lacl, la secuencia que codifica ampicilina (bla), el origen de replicación de pBR322, la región promotora de T7, la región terminadora de T7 y

la Fig 2 describe un espectro de masas extraído y deconvolucionado de pACSH294 incubado con pACSH239 durante una noche a 25 grados Celsius. Con una relación de 1:1 entre la enzima y el sustrato, el péptido S661 (482,1 Da) se detecta claramente, así como el marcador liberado + enlazador (1168,4 Da). No se detectó proteína de fusión intacta, lo que indica que la proteína de fusión se había escindido completamente en la parte del marcador y el péptido S661. El eje Y indica la intensidad de los iones medidos. Eje X indica la masa molecular en Dalton (Da).

Descripción de la invención

La presente invención proporciona nuevas enzimas de procesamiento que se pueden utilizar para la modificación de proteínas, p. ej., para escindir proteínas de... [Seguir leyendo]

1. Enzima de procesamiento que comprende un marcador fijado en el extremo N-terminal, en donde el marcador consiste en una secuencia peptfdica procedente de la familia L9 de proteínas ribosómicas procedentes de bacterias termófilas, en donde el marcador tiene de 15 a 25 aminoácidos, en donde el marcador comprende al menos 15% de residuos de aminoácidos básicos, Lys y Arg, y en donde el marcador tiene un pl superior a 9.

2. Enzima de procesamiento según la reivindicación 1, en la que el marcador se fija a la enzima de procesamiento a través de una secuencia enlazadora.

3. Enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el marcador no comprende residuos de cisterna.

4. Enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el marcador comprende de 5 a 25, o de 75 a 2, de 1 a 25 o de 1 a 2 residuos de aminoácidos.

5. Enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el marcador comprende de 2 a 5% de residuos de aminoácidos básicos.

6. Enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el marcador se selecciona entre el grupo de secuencias peptídicas que consisten en

MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKI LKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPG GVKDTIKIRVEREE(SEQ ID NO:1);

MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKR LAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEYV LTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQ ID NO: 41);

MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFK.QGIAIEATPAMKALEAQKQKEQRQMEEL AN AK KLKEE LEKLTVEIP AK AG EGGRLFGSITSKQIAEA LQAQ HGLK LDKR KIELA DAIRSLGY TNVPVKLHPEVTATLKVHVK£OK(S£Q ID MO: 42) y

MKVVLLKDVS KIGKKGEIKN VSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR-KKEEEKIQ IKTQNEELLKMLKKFLYKIP VKAGESGKLFGALTNSDIAK AVEKIADVNI DKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGK IKVEVIQEGKN(SEQ ID NO: 43).

7. Enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde la secuencia del enlaza- dor tiene de 1 a 3, de 1 a 25, de 1 a 2 o de 1 a 15 residuos de aminoácidos.

8. Enzima de procesamiento según la reivindicación 7, en la que el enlazador se selecciona a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48.

9. Enzimas de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que se seleccionan a partir de oxi- dorreductasas, transferasas, hidrolasas, Nasas, isomerasas y ligasas.

1. Estructura artificial de ácido nucleico que codifica la enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Método para la preparación de una enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende;

i) la expresión de la enzima de procesamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9,

ii) cargar dicha enzima de procesamiento expresada sobre una columna de intercambio catiónico, y

iii) eluir dicha enzima de procesamiento con un eluyente adecuado.

12. Método según la reivindicación 11, en donde la enzima de procesamiento es una proteasa seleccionada entre el grupo que consiste en proteasa HRV14 3C, proteasa HAV18 3C, proteasa TEV y RHDV 3C.

13. Método para modificar un precursor de proteína diana que comprende las etapas de hacer reaccionar una enzima de procesamiento marcada en el extremo N-terminal según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con el precursor de la protema diana y separar la proteína diana de la enzima de procesamiento.

14. Método según la reivindicación 13, en donde la enzima de procesamiento marcada en el extremo N-terminal 5 y el precursor de la proteína diana se coexpresan en un hospedador adecuado que permite el aislamiento de la proteína diana después de la expresión.

15. Método según la reivindicación 14, en donde dicho hospedador se selecciona a partir de las cepas de Baci- llus, Streptomyces y Escherichia coli.