Ensayo diagnóstico de sensibilidad a los inhibidores de la quinasa B-Raf.

Método para determinar la sensibilidad de las células de cáncer a un inhibidor de B-Raf quinasa,

comprendiendo el método:

- obtener una muestra de ácidos nucleicos a partir de células de cáncer de un paciente que presenta un cáncer, - amplificar una secuencia polinucleotídica diana en la muestra de ácidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleotídica diana, en la que la secuencia polinucleotídica diana comprende un sitio de mutación V600E, V600E o V600K en BRAF y la amplificación se lleva a cabo en presencia de una sonda oligonucleótida marcada que comprende SEC ID nº 1, en la que 'n' es desoxiinosina y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio de mutación V600E, V600D o V600K en BRAF, y - detectar la presencia o ausencia de una mutaciáon V600E, V600E o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cáncer al inhibidor de B-Raf.

Ensayo diagnïstico de sensibilidad a los inhibidores de la quinasa B-Raf

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

El gen BRAF codifica B-Raf, una serina/treonina quinasa, que acopla la seïalizaciïn de RAS activado con las MAPK quinasas posteriores (Wellbrock et al., Cancer Res. 64:2338-2342, 2004) . Las mutaciones oncogïnicas en B-Raf resultan en una ganancia de funciïn de quinasa, de manera que la ruta de Raf-MEK-ERK resulta constitutivamente activa en ausencia de los factores de crecimiento tïpicos. Esta activaciïn constitutiva se correlaciona con un mal pronïstico en el melanoma metastïsico (Houben et al., supra, 2004) . Se ha informado de mutaciones activadoras en BRAF en una diversidad de neoplasias. Por ejemplo, se encuentran presentes mutaciones en BRAF hasta en 70% de los casos de melanoma humano. Una mutaciïn de una sola base (T>A) en la posiciïn nucleotïdica 1.799 en el codïn 600 del exïn 15 conduce a una sustituciïn de valina por glutamato (V600E) , que se encuentra presente en mïs de 85% de los melanomas con una mutaciïn en B-Raf (Davies et al., Nature 417: 949-954, 2002; Garnett y Marais, Cancer Cell 6: 313-319, 2004; Gray-Schopfer et al., Cancer Metastasis Rev. 24:165-183, 2005; Houben et al., 2004) . Menos comïnmente, V600E resulta de la mutaciïn de dos bases TG>AA en las posiciones nucleotïdicas 1799-1800 (Houben et al., J. Carcinog. 3:6, 2004) .

Se conocen varios inhibidores de quinasa, incluyendo los que inhiben B-Raf. Entre dichos inhibidores se incluyen PLX4032, que inhibe selectivamente la actividad de quinasa de B-Raf V600E. La presente invenciïn proporciona mïtodos de identificaciïn de los pacientes positivos para V600E con el fin de seleccionar el tratamiento con un inhibidor de B-Raf quinasa, por ejemplo PLX4032.

Langland et al., 2006 ("Development of a companion diagnostic test for inhibitors of V600E BRAF", URL: http://aacrmeetingabstracts.org/cgi/content/abstract/2006/2/A13) da a conocer un mïtodo para determinar la sensibilidad de las cïlulas de cïncer a PLX4032 basïndose en la detecciïn de la mutaciïn BRAFV600E mediante PCR TaqMan en tiempo real. Sin embargo, no se dan a conocer secuencias de ningïn cebador o sonda especïfico.

DESCRIPCIïN RESUMIDA DE LA INVENCIïN

La invenciïn proporciona mïtodos y kits para la detecciïn de pacientes que son candidatos al tratamiento con un inhibidor de B-Raf quinasa. De esta manera, en un aspecto, la invenciïn proporciona un mïtodo para determinar la sensibilidad de las cïlulas de cïncer a un inhibidor de B-Raf, comprendiendo el mïtodo: (i) proporcionar una muestra de ïcidos nucleicos procedentes de cïlulas de cïncer de un paciente que presenta un cïncer, (ii) amplificar una secuencia polinucleïtida diana en la muestra de ïcidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleotïdica diana, en la que la secuencia polinucleotïdica diana comprende un sitio mutado V600E, V600D o V600K en BRAF y se lleva a cabo la amplificaciïn en presencia de una sonda oligonucleïtida marcada que comprende la secuencia indicada en SEC ID nï 1, en la que "n" es desoxiinosina, y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio mutado V600E en BRAF, e (iii) detectar la presencia o ausencia de un sitio mutado V600E, V600D o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cïncer al inhibidor de B-Raf. En algunas realizaciones, la sonda presenta la secuencia de nucleïtidas indicada en SEC ID nï 1. La amplificaciïn puede llevarse a cabo en presencia de una segunda sonda que detecta la presencia de una secuencia de tipo salvaje en el sitio de mutaciïn V600E. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende por lo menos 15 nucleïtidos de SEC ID nï 2. En algunas realizaciones, la segunda sonda presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2. En determinadas realizaciones, la sonda puede marcarse con un marcaje fluorescente. La sonda puede marcarse ademïs con dos marcajes, en la que uno de los marcajes es un pigmento fluorescente y el otro marcaje es una fracciïn inhibidora.

En algunas realizaciones, ambos cebadores de la pareja de cebadores utilizada en la reacciïn de amplificaciïn se hibridan con el exïn 15 de BRAF. En algunas realizaciones, uno de los cebadores de la pareja de cebadores utilizada en las reacciones de amplificaciïn comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidas indicada en SEC ID nï 3, por ejemplo uno de los cebadores en la pareja de cebadores puede presentar la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 3. En realizaciones adicionales, uno de los cebadores en las parejas de cebadores comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 4. Por ejemplo, el cebador puede presentar la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 4. En realizaciones adicionales, la pareja de cebadores utilizada para la amplificaciïn comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleïtidos indicadas en SEC ID nï 3 y SEC ID nï 4.

En algunas realizaciones, la etapa de amplificar la reacciïn comprende una RT-PCR.

El mïtodo puede utilizarse para detectar cïnceres que presentan una mutaciïn en la posiciïn aminoïcida 600 de B-Raf, por ejemplo una mutaciïn V600E. En algunas realizaciones el cïncer es melanoma. En otras realizaciones, el

cïncer es cïncer de colon o cïncer de tiroides. En algunas realizaciones, la muestra de ïcidos nucleicos utilizada en los mïtodos de la invenciïn para detectar la mutaciïn puede proceder de una biopsia de la piel. En otras realizaciones la muestra es de una biopsia de colon. La muestra tambiïn puede proceder de tejido incluido en parafina. El mïtodo de la invenciïn puede comprender ademïs el registro de un diagnïstico de que el paciente es sensible a un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf especïfico de mutante, por ejemplo PLX4032.

En algunas realizaciones de la invenciïn, el mïtodo comprende ademïs la administraciïn de un inhibidor de B-Raf en el paciente. El inhibidor de B-Raf puede ser un inhibidor de B-Raf especïfico de mutante, tal como PLX4032.

En otro aspecto, la invenciïn proporciona un mïtodo para identificar un candidato para el tratamiento con PLX4032, comprendiendo el mïtodo: obtener una muestra de un sujeto y detectar una molïcula biolïgica que comprende una mutaciïn V600E en BRAF a partir de la muestra, identificando de esta manera el candidato para el tratamiento con PLX4032. En algunas realizaciones la molïcula biolïgica es un ïcido nucleico. En otras realizaciones la molïcula biolïgica es un polipïptido. El polipïptido puede obtenerse, por ejemplo, de una muestra que comprende cïlulas de cïncer del paciente. En algunas realizaciones, el polipïptido puede detectarse utilizando un inmunoensayo. El mïtodo puede comprender ademïs la administraciïn de PLX4032 en el sujeto.

En otro aspecto, la invenciïn proporciona un kit para detectar un paciente que es un candidato para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf, en el que el kit comprende una primera sonda especïfica de alelo, en el que la primera sonda resulta adecuada para detectar una mutaciïn V600E, V600D o V600K en BRAF y comprende la secuencia indicada en SEC ID nï 1. En algunas realizaciones, la sonda presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 1. Un kit de la invenciïn puede comprender ademïs una segunda sonda especïfica de alelo, en el que la segunda sonda detecta la secuencia de BRAF de tipo salvaje y comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2. En algunas realizaciones la segunda sonda presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2.

En realizaciones adicionales, un kit de la invenciïn comprende ademïs una pareja de cebadores que amplifica una regiïn diana de BRAF que comprende un sitio de mutaciïn V600E. Por ejemplo, la pareja de cebadores puede comprender un cebador que comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 3. En determinado aspecto, el cebador presenta la secuencia de nucleïtidos inidcada en SEC ID nï 3. En otras realizaciones, la pareja de cebadores puede comprender cebadores que comprenden por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 3 y SEC ID nï 4. En algunas realizaciones, la pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleïtidos indicadas en SEC ID nï 3 y SEC ID nï 4.

De esta manera, en algunas realizaciones, un kit de la invenciïn puede comprender: una sonda que presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 1; una sonda que presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2; un cebador... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo para determinar la sensibilidad de las cïlulas de cïncer a un inhibidor de B-Raf quinasa, comprendiendo el mïtodo:

- obtener una muestra de ïcidos nucleicos a partir de cïlulas de cïncer de un paciente que presenta un cïncer,

-amplificar una secuencia polinucleotïdica diana en la muestra de ïcidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleotïdica diana, en la que la secuencia polinucleotïdica diana comprende un sitio de mutaciïn V600E, V600E o V600K en BRAF y la amplificaciïn se lleva a cabo en

presencia de una sonda oligonucleïtida marcada que comprende SEC ID nï 1, en la que 'n' es desoxiinosina y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio de mutaciïn V600E, V600D o V600K en BRAF, y - detectar la presencia o ausencia de una mutaciïon V600E, V600E o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cïncer al inhibidor de B-Raf.

2. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que la amplificaciïn se lleva a cabo en presencia de una segunda sonda que detecta la presencia de una secuencia de tipo salvaje en el sitio de mutaciïn V600E, V600D o V600K.

3. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 2, en el que la segunda sonda comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2.

4. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que uno de los cebadores en la pareja de cebadores comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 3.

5. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que uno de los cebadores en la pareja de cebadores comprende por 25 lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 4.

6. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que la etapa de amplificar la reacciïn comprende una RT-PCR.

7. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que el inhibidor de B-Raf quinasa es un inhibidor de B-Raf quinasa 30 especïfico de mutante.

8. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que el inhibidor de B-Raf quinasa es PLX4032.

9. Kit para detectar un paciente que es un candidato para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf, en el que

el kit comprende una primera sonda especïfica de alelo, en el que la primera sonda resulta adecuada para detectar una mutaciïn V600E, V600D o V600K en BRAF y que comprende la secuencia indicada en SEC ID nï 1, en la que 'n' es desoxiinosina.

10. Kit segïn la reivindicaciïn 9, que comprende ademïs una segunda sonda especïfica de alelo, en el que la segunda sonda detecta la secuencia de BRAF de tipo savlaje y comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2.

11. Kit segïn la reivindicaciïn 9, que comprende ademïs una pareja de cebadores que amplifica una regiïn diana de BRAF que comprende un sitio de mutaciïn V600E, V600D o V600K.

12. Kit segïn la reivindicaciïn 11, en el que la pareja de cebadores comprende un cebador que comprende por lo menos 15 nucleïtidos contiguos de la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 3.

13. Kit segïn la reivindicaciïn 11, en el que la pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las 50 secuencias indicadas en SEC ID nï 3 y SEC ID nï 4.

14. Kit segïn la reivindicaciïn 9, en el que la primera sonda presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï y el kit comprende ademïs una segunda sonda que presenta la secuencia de nucleïtidos indicada en SEC ID nï 2 y una pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleïtidos 55 indicadas en SEC ID nï 3 y SEC ID nï 4.