Ensayo de anticuerpos antifármaco.

Método para la determinación inmunológica de un anticuerpo frente a un anticuerpo de fármaco en una muestra usando un inmunoensayo de doble unión a antígenos que comprende un a anticuerpo de fármaco de captura y un anticuerpo de fármaco indicador,

caracterizado por que

i) el anticuerpo de fármaco de captura es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la fase sólida; y

ii) el anticuerpo de fármaco indicador es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la marca detectable.

Ensayo de anticuerpos antifármaco La invención comprende un método para la determinación de anticuerpos antifármaco y kits para el uso de dichos ensayos.

Antecedentes de la invención Los inmunoensayos convencionales en fase sólida con anticuerpos monoclonales implican la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado sobre una fase sólida (anticuerpo de captura) , el antígeno, y un anticuerpo a otro epítopo del antígeno conjugado con una enzima (anticuerpo indicador) . Por lo tanto, se forma un sándwich: fase sólida-anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo indicador. En la reacción catalizada por el sándwich, la actividad de la enzima conjugada con anticuerpos es proporcional a la concentración de antígenos en el 15 medio de incubación. El método de sándwich convencional también se denomina inmunoensayo de doble unión a antígenos debido a que anticuerpos de captura e indicadores se unen a diferentes epítopos del antígeno. Hoesel, W., et al., en J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110, informan de un ensayo de doble unión a antígenos anti-EPO mediante el cual se usó una mezcla de rhEPO inmovilizada acoplada a grupos amino y a grupos hidrato de carbono. Los inmunoensayos tales como ELISA de doble unión a antígenos son tipos de ensayos comunes en la investigación de una respuesta inmunogénica de un paciente a un fármaco de anticuerpo. Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16, resumen las recomendaciones para el diseño y la optimización de inmunoensayos que usan la detección de anticuerpos huésped frente a productos de biotecnología. De acuerdo con Mire-Sluis et al., los formatos de ensayo de anticuerpos antifármaco bien conocidos muestran desventajas considerables. Se mencionan ensayos de anticuerpos antifármaco, por ejemplo, en el documento WO 2005/045058 y en el documento WO 25 90/006515. Se mencionan ensayos de anticuerpos anti-idiotípicos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.219.730; documento WO 87/002778; documento EP 0 139 389; y documento EP 0 170 302. Wadhwa, M., et al., en J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17, informan de estrategias para la detección, medida y caracterización de anticuerpos no deseados inducidos por agentes biológicos terapéuticos.

Bourdage, J.S. et al. en J. Pharm. Biomed. Anal_39_ (2005) _685-690 informaron de un efecto de formato de inmunoensayo de doble unión a antígenos sobre la dependencia de la concentración del revestimiento del antígeno e implicaciones para el diseño de ensayos de inmunogenicidad para anticuerpos monoclonales. Un inmunoensayo cinético de enzimas para la cuantificación de anticuerpos a un anticuerpo monoclonal humanizado en suero humano se informa en Thurmond, L., M. et al. (J. Pharm. Biomed. Anal_16_ (1998) _1317-1328) . Baert, F. et al. _N. Engl. J.

Med_348_ (2003) _601-608 informan sobre la influencia de la inmunogenicidad en la eficacia a largo plazo del infliximab en la Enfermedad de Crohn.

Sumario de la Invención La invención proporciona métodos y medios para la determinación inmunológica de un anticuerpo frente a un anticuerpo de fármaco en una muestra usando un inmunoensayo doble de unión a antígenos.

La invención proporciona un método para la determinación inmunológica de un anticuerpo frente a un anticuerpo de fármaco en una muestra usando un inmunoensayo de doble unión a antígenos que comprende un anticuerpo de 45 fármaco de captura y un anticuerpo de fármaco indicador, caracterizado por que el anticuerpo de fármaco de captura es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la fase sólida, y el anticuerpo de fármaco indicador es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la marca detectable.

Preferentemente, la conjugación del anticuerpo de fármaco con su compañero de conjugación se realiza mediante unión por vía química a través de grupos N-terminales y/o ε-amino (lisina) , grupos ε-amino de lisinas diferentes, grupos con funcionalidad carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólica de la cadena principal del aminoácido del anticuerpo de fármaco y/o grupos de alcohol de azúcar de la estructura del hidrato de carbono del anticuerpo de 55 fármaco.

Preferentemente, la mezcla de anticuerpo de fármaco de captura comprende el anticuerpo de fármaco conjugado a través de un grupo amino y a través de una estructura de hidrato de carbono a su compañero de conjugación.

Preferentemente, la mezcla de anticuerpo de fármaco de captura y/o la mezcla de anticuerpo de fármaco indicador comprende el anticuerpo de fármaco, conjugado a través de al menos dos grupos amino diferentes, con su compañero de conjugación. Dicho acoplamiento a través de grupos amino diferentes se puede realizar por acilación de una parte de los grupos ε-amino con agentes de protección química, por ejemplo por citraconilación, en una primera etapa. En una segunda etapa, la conjugación se realiza a través de los grupos amino restantes. 65 Posteriormente, se retira la citraconilación y el anticuerpo de fármaco se conjuga con el compañero de conjugación a través de grupos amino libre restantes, es decir, el anticuerpo de fármaco obtenido se conjuga con el compañero de

conjugación a través de grupos amino que no se han protegido por citraconilación.

Los agentes de protección química adecuados forman enlaces en aminas de cadena lateral sin proteger y son menos estables y diferentes a esos enlaces en el extremo N. Se conocen muchos de dichos agentes de protección química (véase, por ejemplo Solicitud de Patente Europea EP 0 651 761) . Los agentes de protección química preferentes incluyen anhídridos cíclicos de ácido dicarboxílico tales como anhídridos del ácido maleico o citraconílico.

Preferentemente, el anticuerpo de fármaco de captura se conjuga con la fase sólida mediante adsorción pasiva y por lo tanto se conjuga con la fase sólida en al menos dos sitios diferentes del anticuerpo. La adsorción pasiva se describe, por ejemplo, en Butler, J. E., en "Solid Phases in Immunoassay" 205-225; Diamandis, E.P., y Christopoulos, T.K. (Editors) : Immunoassays (1996) Academic Press San Diego.

Preferentemente, la mezcla de anticuerpo de fármaco indicador comprende el anticuerpo de fármaco conjugado a 15 través de un grupo amino y a través de una estructura de hidrato de carbono a su compañero de conjugación.

Preferentemente, la relación de anticuerpo de fármaco de captura a anticuerpo de fármaco indicador es de 1:10 a 50:1 (relación se refiere a relación de moléculas de anticuerpo independientemente del peso molecular de los conjugados que puede ser diferente) .

Preferentemente, la relación de anticuerpo de fármaco conjugado con amino (anticuerpo de fármaco indicador o de captura) a anticuerpo de fármaco conjugado con hidrato de carbono (anticuerpo de fármaco indicador o de captura) en una mezcla de modo que sea de 1:10 a 10:1 (relación se refiere a relación de moléculas de anticuerpo independientemente del peso molecular de los conjugados que puede ser diferente) .

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de fármaco de captura se conjuga (inmoviliza) a través de un par de unión específico. Dicho par de unión (primer componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) , lectina/polisacárido, proteína de unión esteroide/esteroide, receptor de hormona/hormona, enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. Preferentemente, el anticuerpo de fármaco de captura se conjuga con biotina y la inmovilización se realiza a través de avidina o estreptavidina inmovilizada.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de fármaco indicador se conjuga con una marca detectable, preferentemente se conjuga a través de un par de unión específico. Dicho par de unión (primer 35 componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) , lectina/polisacárido, proteína de unión esteroide/esteroide, receptor de hormona/hormona, enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. Preferentemente, el anticuerpo de fármaco indicador se conjuga a través de digoxigenina y un anticuerpo frente a digoxigenina con la marca detectable. Como alternativa, el anticuerpo de fármaco indicador se conjuga con una marca electroquimioluminiscente,... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación inmunológica de un anticuerpo frente a un anticuerpo de fármaco en una muestra usando un inmunoensayo de doble unión a antígenos que comprende un a anticuerpo de fármaco de captura y un 5 anticuerpo de fármaco indicador, caracterizado por que i) el anticuerpo de fármaco de captura es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la fase sólida; y ii) el anticuerpo de fármaco indicador es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármaco que difieren en el sitio del anticuerpo al que se conjugan con la marca detectable.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la conjugación del anticuerpo del fármaco con su compañero de conjugación se realiza mediante unión por vía química a través de grupos N-terminales y/o εamino (lisina) , grupos ε-amino de lisinas diferentes, grupos con funcionalidad carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólica de la cadena principal del aminoácido del anticuerpo de fármaco y/o grupos alcohol de azúcar de la estructura de hidrato de carbono del anticuerpo de fármaco.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la mezcla de anticuerpo de fármaco indicador comprende el anticuerpo de fármaco conjugado a través de un grupo amino y a través de una estructura de hidrato de carbono con su compañero de conjugación.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la mezcla de anticuerpo de fármaco de captura comprende el anticuerpo de fármaco conjugado a través de un grupo amino y a través de una estructura de hidrato de carbono con su compañero de conjugación.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la conjugación del anticuerpo de fármaco de captura con la fase sólida se realiza mediante adsorción pasiva. 30

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la relación de anticuerpo de fármaco de captura a anticuerpo de fármaco indicador es de 1:10 a 50:1 (relación se refiere a relación de moléculas de anticuerpo independientemente del peso molecular de los conjugados que puede ser diferente) .

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la relación de anticuerpo de fármaco conjugado con amino (anticuerpo de fármaco indicador o de captura) a anticuerpo de fármaco conjugado con hidrato de carbono (anticuerpo de fármaco indicador o de captura) en dicha mezcla es de 1:10 a 10:1 (elación se refiere a relación de moléculas de anticuerpo independientemente del peso molecular de los conjugados que puede ser diferente) .

8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6 a 7, caracterizado por que el anticuerpo de fármaco de captura se inmoviliza a través de un par de unión específico.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que el anticuerpo de fármaco de captura se conjuga 45 con biotina y la inmovilización se realiza a través de avidina o estreptavidina inmovilizadas.

10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el anticuerpo de fármaco indicador se conjuga con la marca detectable a través de un par de unión específico.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que el anticuerpo de fármaco indicador se conjuga con digoxigenina y la unión a la marca detectable se realiza a través de un anticuerpo frente a digoxigenina.