Ensayo de activación de monocitos perfeccionado capaz de detectar contaminantes pirogénicos no endotoxínicos en productos médicos.

Ensayo de pirógenos in vitro que comprende los pasos de:

a) combinar un reactivo que contiene monocitos y una muestra a ensayar en un primer sistema de ensayo que incluye una placa de microtitulación que comprende múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado,

para proporcionar un mayor contacto entre célula y célula en comparación con un pocillo de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana, sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie de cada pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno;

b) incubar el reactivo que contiene monocitos y la muestra donde, cuando la muestra incluye un pirógeno, el reactivo que contiene monocitos produce una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria;

c) transferir el contenido del primer sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para la citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria; y

d) analizar el segundo sistema de ensayo en cuanto a la presencia de citoquina o mediador endógeno unido al anticuerpo sobre la superficie, indicando un nivel elevado de la citoquina o mediador endógeno unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

DESCRIPCIÓN

Ensayo de activación de monocitos perfeccionado capaz de detectar contaminantes pirogénicos no endotoxínicos en productos médicos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En general, la presente invención se refiere a un ensayo de activación de monocitos perfeccionado capaz de 5 detectar pirógenos no endotoxínicos en productos médicos, donde se incuba una muestra con un reactivo que contiene monocitos en un sistema de ensayo que incluye al menos una superficie que comprende polipropileno. La invención también se refiere a sistemas de ensayo para su uso en estas pruebas, que incluyen al menos un pocillo de microtitulación con al menos una superficie interior que comprende polipropileno y que presenta una forma tal que el reactivo que contiene monocitos se concentra en el pocillo para proporcionar un mayor contacto entre célula y 10 célula. La invención también se refiere a un kit de diagnóstico útil para analizar la presencia de pirógenos no endotoxínicos en una muestra. La invención se presenta en las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cuando determinados compuestos químicos o biológicos entran en contacto con el sistema circulatorio de humanos u otros mamíferos, pueden provocar una respuesta sistémica conocida como respuesta inflamatoria o inflamación. 15 La respuesta inflamatoria es un mecanismo de defensa para proteger el cuerpo contra infecciones y/o lesiones; la inflamación aumenta el flujo sanguíneo en el lugar de la infección o lesión, aportando fluidos necesarios, proteínas y glóbulos blancos (leucocitos) para favorecer el proceso de curación. Por ejemplo, un síntoma asociado a la respuesta inflamatoria es un aumento de la temperatura corporal o fiebre, que actúa como un mecanismo de defensa para los patógenos que provoca un sobrecalentamiento. La respuesta inflamatoria se puede asociar a 20 diversos síntomas "similares a los de la gripe", incluyendo fiebre, escalofríos, fatiga, dolores de cabeza, pérdida de apetito y rigidez muscular. Los compuestos químicos o biológicos que provocan fiebre se denominan históricamente como "pirógenos" o compuestos "pirogénicos", en referencia a la respuesta febril que pueden provocar estos compuestos. No obstante, algunos compuestos químicos o biológicos son generalmente proinflamatorios y pueden provocar o no fiebre como parte de la respuesta inflamatoria causada por los mismos. 25

En algunos casos, dependiendo de la sensibilidad del individuo y del tipo y concentración del pirógeno al que éste está expuesto, después de quedar expuesto a un pirógeno el individuo puede desarrollar síntomas de tipo colapso con peligro para la vida. Los productos médicos que pueden ser inhalados, inyectados o administrados por infusión y los dispositivos médicos tales como membranas o materiales implantados presentan un riesgo particular de pirogenicidad. Incluso los nutrientes pueden presentar riesgo de pirogenicidad. Los pirógenos contenidos en 30 productos médicos y nutrientes se denominan pirógenos exógenos; en cambio, los pirógenos endógenos son compuestos mensajeros del sistema inmunológico que inducen una respuesta inflamatoria del individuo a pirógenos exógenos. Además de la naturaleza pirogénica de un producto en sí o de productos secundarios de su producción, con frecuencia una contaminación del producto puede provocar pirogenicidad. La pirogenicidad debida a la contaminación de un producto puede estar causada por uno cualquiera de un grupo de pirógenos diversos derivados 35 de bacterias, virus, hongos o incluso del huésped. Este problema puede persistir incluso si el producto se "esteriliza" térmicamente o por métodos químicos. Un compuesto pirogénico comúnmente encontrado, la endotoxina bacteriana (que consiste principalmente en un lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de bacterias Gram negativas) , puede permanecer después de la destrucción de las bacterias. Por consiguiente, para garantizar la seguridad de diversas sustancias farmacéuticas, nutrientes y productos médicos de administración parenteral, es necesario analizar la 40 presencia de pirógenos en estos productos.

Normalmente, los compuestos que actúan como pirógenos lo hacen estimulando la producción de pirógenos endógenos, como prostaglandinas y citoquinas proinflamatorias, en monocitos, después de un contacto con tejido, células o fluidos corporales. Son estos pirógenos producidos de forma endógena los que influyen en la respuesta inflamatoria en el organismo afectado. Los más importantes y conocidos de estos pirógenos endógenos son las 45 citoquinas interleuquina-1 (IL-1) , interleuquina-6 (IL-6) , interleuquina-8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral (TNF) y el mediador de lípido de bajo peso molecular prostaglandina E2 (PGE2) . Estos compuestos se ensayan rutinariamente mediante ELISA o ensayos inmunoadsorción enzimática (en el caso de la IL-1, la IL-6 o el TNF) y mediante EIA o inmunoensayo enzimático (en el caso de la PGE2) .

Con el fin de evitar una reacción pirogénica y garantizar la seguridad de cualquier fármaco o producto farmacéutico 50 administrado vía parenteral es necesario controlar la contaminación pirogénica para identificar lotes individuales contaminados con contaminantes bacterianos. Actualmente se utilizan rutinariamente dos métodos farmacológicos basados en animales, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) , también denominado ensayo de endotoxinas bacterianas (BET) , y el ensayo de pirógenos en conejos, para controlar la contaminación por pirógenos en productos farmacéuticos fabricados a granel. 55

El ensayo en conejos es un ensayo in vivo que consiste en inyectar el compuesto de muestra a una cantidad estadísticamente significativa de conejos y observar el aumento medio de la temperatura corporal provocado en los animales de ensayo. Aunque el ensayo en conejos responde a un amplio espectro de agentes pirógenos, incluyendo pirógenos no endotoxínicos, dicho ensayo presenta una sensibilidad relativamente baja (ng endotoxina/ml) en comparación con otros ensayos de pirógenos (pg endotoxina/ml en el caso del ensayo LAL) . Además, la correlación 5 de las respuestas pirogénicas a los compuestos entre especies es aproximada en el mejor de los casos. Por ejemplo, se ha documentado que la dosis de endotoxina bacteriana que provoca una respuesta pirogénica varía hasta en un factor 10.000 entre especies. La sensibilidad relativamente baja, los malos resultados cuantitativos, la variabilidad entre especies de conejos y los aspectos éticos que implican los ensayos con animales han provocado la desaprobación del ensayo en conejos en los últimos años. 10

A diferencia del ensayo en conejos, que detecta una amplia gama de pirógenos, el ensayo LAL solo detecta pirógenos endotoxínicos. La endotoxina bacteriana, por ejemplo lipopolisacárido (LPS) , que procede de la pared celular de bacterias Gram negativas, es uno de los compuestos pirogénicos mejor descritos (Moltz y col., Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17, 237-269; Tilders y col., Psychoneuroendocrinology, 1994, 19, 209-232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8, 1-10; Zeisberger y Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, 106-109) . Por ello, generalmente 15 se ha considerado útil sustituir los experimentos con conejos, que son costosos y requieren mucho tiempo, por un ensayo LAL directo para la endotoxina bacteriana. Este método tiene limitaciones obvias. El ensayo LAL es un ensayo in vitro muy sensible; sin embargo, sólo detecta endotoxinas de bacterias Gram negativas y da falsos resultados negativos con determinados productos que pueden estimular monocitos para producir citoquinas pirogénicas. El ensayo LAL es también susceptible de interferencia, por ejemplo por altos niveles proteínicos de 20 sustancias de ensayo o por glucanos (Roslansky y Novitsky, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2477; Fennrich y col., Dev. Biol. Stand., 1999, 101, 131) . Por otro lado, el ensayo de Limulus es tan sensible que es muy propenso a dar falsos resultados positivos debido a impurezas que no son importantes para la calidad del producto (Fujiwara y col., Yakugaku Zasshi, 1990, 110, 332-340) .

Por consiguiente, existe la necesidad de un sistema de ensayo no basado en animales que se caracterice por una 25 alta sensibilidad, una alta especificidad y capacidad para detectar una amplia gama de pirógenos. Con este propósito y con un mejor entendimiento de la respuesta inflamatoria humana se han desarrollado sistemas de ensayo basados en la activación in vitro de monocitos humanos. Hace unos 20 años, algunos investigadores utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para detectar endotoxina mediante el control de la liberación de citoquinas pirogénicas (Dinarello y col., J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 323; Duff y... [Seguir leyendo]

1. Ensayo de pirógenos in vitro que comprende los pasos de:

a) combinar un reactivo que contiene monocitos y una muestra a ensayar en un primer sistema de ensayo que incluye una placa de microtitulación que comprende múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado, para proporcionar un mayor contacto entre 5 célula y célula en comparación con un pocillo de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana, sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie de cada pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno;

b) incubar el reactivo que contiene monocitos y la muestra donde, cuando la muestra incluye un pirógeno, el 10 reactivo que contiene monocitos produce una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria;

c) transferir el contenido del primer sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para la citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria; y 15

d) analizar el segundo sistema de ensayo en cuanto a la presencia de citoquina o mediador endógeno unido al anticuerpo sobre la superficie, indicando un nivel elevado de la citoquina o mediador endógeno unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

2. Ensayo de pirógenos in vitro, que comprende los pasos de:

(a) combinar un reactivo que contiene monocitos y una muestra a ensayar en un primer sistema de ensayo que 20 incluye (i) una placa de microtitulación que comprende múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado para proporcionar un mayor contacto entre célula y célula en comparación con un pocillo de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo que no plana, sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie de cada pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o 25 estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno, donde, cuando la muestra incluye un pirógeno, el reactivo que contiene monocitos produce una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria, y (ii) al menos una superficie tratada con un anticuerpo para la citoquina o mediador endógeno de la respuesta inflamatoria;

(b) incubar el reactivo que contiene monocitos y la muestra; y 30

(c) analizar el sistema de ensayo en cuanto a la presencia de citoquina o mediador endógeno unido al anticuerpo sobre la superficie, indicando un nivel elevado de la citoquina o mediador endógeno unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

3. Ensayo de pirógenos in vitro según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la muestra es un producto farmacéutico, un nutriente o un producto médico. 35

4. Ensayo de pirógenos in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citoquina o el mediador endógeno de la respuesta inflamatoria es una citoquina proinflamatoria o una citoquina Th1.

5. Ensayo de pirógenos in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citoquina o el mediador endógeno de la respuesta inflamatoria es IL-2, IFN, IL-1, IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF-ï?¡ o 40 endotelina.

6. Ensayo de pirógenos in vitro según la reivindicación 1, caracterizado porque los lados de dicho pocillo de microtitulación están inclinados hacia adentro.

7. Ensayo de pirógenos in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende células mononucleares de sangre periférica o células de líneas 45 celulares monocíticas, opcionalmente, comprendiendo la línea celular monocítica una línea celular monocítica humana seleccionada de entre el grupo consistente en: MONOMAC-6, THP-1, 28SC, y una línea celular que tiene receptores CD14 y/o tipo Toll endógenos o que ha sido transfectada con receptores CD14 y/o tipo Toll y/o genes indicadores para mediadores inflamatorios o pirogénicos.

8. Ensayo de pirógenos in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el 50 reactivo que contiene monocitos comprende una cantidad de células suficiente para proporcionar al menos o aproximadamente 125.000 células por pocillo del primer sistema de ensayo.

9. Kit de diagnóstico para su uso en el ensayo de pirógenos in vitro según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende (i) un sistema de ensayo que incluye una placa de microtitulación que comprende múltiples pocillos de microtitulación, estando configurado cada pocillo de modo que cuando un reactivo que contiene monocitos está presente en los pocillos de microtitulación, el reactivo que contiene monocitos está concentrado para proporcionar un mayor contacto entre célula y célula en comparación con 5 un pocillo de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana, sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie de cada pocillo un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno, y (ii) un reactivo que contiene monocitos criopreservados que comprende sangre total criopreservada, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) criopreservadas, o células de líneas celulares monocíticas 10 criopreservadas; donde o bien el sistema de ensayo comprende adicionalmente una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, o bien el kit comprende un segundo sistema de ensayo que incluye al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, consistiendo la citoquina o el mediador endógeno en una citoquina o un mediador endógeno producidos por el reactivo que contiene 15 monocitos.

10. Kit de diagnóstico según la reivindicación 9, caracterizado porque la citoquina o el mediador endógeno de una respuesta inflamatoria es IL-2, IFN, IL-1, IL-1 ra, IL-6, IL-8, TNF-ï?¡ o endotelina.

11. Kit de diagnóstico según la reivindicación 9, caracterizado porque cada pocillo de microtitulación de la placa de microtitulación comprende monocitos criopreservados, opcionalmente en la cantidad óptima de células 20 por pocillo.

12. Kit de diagnóstico según la reivindicación 9, caracterizado porque las células mononucleares de sangre periférica criopreservadas o las células de líneas celulares monocíticas criopreservadas están presentes en un pocillo de la placa de microtitulación en una densidad celular de al menos aproximadamente 250.000 células por pocillo. 25

13. Kit de diagnóstico según la reivindicación 9, caracterizado porque la sangre total criopreservada está presente en un pocillo de la placa de microtitulación en una densidad celular de al menos aproximadamente 100.000 PBMC por pocillo.