Eliminación de pelo enzimática de pieles y cueros.

Método para debilitar el pelo en pieles que comprende el tratamiento de cueros o pieles con una cantidad eficaz de glutamil endopeptidasa en una solución acuosa.

Eliminaciïn de pelo enzimïtica de pieles y cueros

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma informïticamente legible.

CAMPO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn se refiere a un mïtodo para debilitar el pelo en pieles que utilizan una glutamil endopeptidasa. Ademïs, se refiere a un proceso de ribera (beamhouse) mïs rïpido y mïs respetuoso con el medio ambiente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Los procesos de ribera tradicionales o el proceso hïmedo limpian las pieles y los cueros y los preparan para otro tratamiento como recurtido, engrasado, tintura y acabado. El proceso de ribera incluye los pasos de remojo (eliminaciïn de suciedad y rehidrataciïn) , eliminaciïn de pelo (eliminaciïn de pelo, generalmente parte del proceso de encalado) , encalado (eliminaciïn de pelo y liberaciïn de grasas y proteïnas al igual que inflamaciïn de la estructura de colïgeno) , descarnado (eliminaciïn de tejido adiposo) , divisiïn (corte horizontal en la divisiïn del grano y divisiïn de carne) , desencalado (liberaciïn de cal y reducciïn de pH) , rendido (eliminaciïn de proteïnas, eliminaciïn de rabito y apertura de fibra) , y piquelado (reducciïn del valor de pH alrededor de 3) y curtido (estabilizaciïn de la piel o matriz de cuero) . El producto de este proceso es generalmente conocido como wet blue.

Las enzimas se han usado en la industria del cuero desde hace 100 aïos aproximadamente (Uhlig, capïtulo 5.9 en Industrial Enzymes and their application 1998 por John Weiley & Sons) . Actualmente, las enzimas se usan con ïxito relativo en el remojo, la eliminaciïn de pelo, el baïo y el desengrasado (Thanikaivelan et al, 2004, Trend in Biotechnology 22, 181-187) .

La eliminaciïn apropiada del pelo de la superficie externa y de los folïculos pilosos es muy importante para asegurar la superficie lisa y blanda del grano y para asegurar la uniformidad en el color del cuero. El mïtodo de eliminaciïn de pelo de cueros y pieles practicado mïs frecuentemente es el procedimiento quïmico que usa cal y sulfuro de sodio. Se estima que menos del 2 % de los procesos de ribera usa enzimas para la eliminaciïn de pelo. El sulfuro principalmente actïa cortando los enlaces de disulfuro de las molïculas de queratina. Esta acciïn se ayuda del hidrïxido cïlcico (cal) , que suelta la estructura de colïgeno a travïs de inflamaciïn y libera proteïnas no colagenosas interfibrilares. Este proceso es el sistema convencional de quema de pelo o de reducciïn de pulpa.

Los mïtodos de eliminaciïn de pelo enzimïtica son conocidos como una alternativa al procedimiento quïmico convencional respetuosa con el medio ambiente. Los ejemplos de eliminaciïn de pelo enzimïtica estïn descritos en US 3, 840, 433, US 4, 636, 222, WO 1994/06942, US 5, 834, 299 y WO 2008/093353. La enzima digiere las cïlulas basales del bulbo capilar y las cïlulas de la capa de Malpighi (los dos estratos mïs internos de la epidermis) . Esto es seguido por la debilitaciïn del pelo con un ataque en la capa mïs exterior y descomposiciïn posterior de la capa de la raïz interna y partes del pelo que no estïn queratinizadas completamente. Las enzimas usadas en la eliminaciïn de pelo son generalmente proteolïticas lo cual cataliza la descomposiciïn de proteïnas. Ejemplos de proteasas que han sido usadas son los extractos de proteasa mïs o menos crudos de origen fïngico o bacteriano que contienen actividades de peptidasa diferentes, al igual que proteasas mïs puras tales como elastasa, subtilisinas, tripsinas, quimiotripsina, proteasas aspïrticas, proteasa de cisteïna y metaloproteasas. No obstante, debido a que las pieles y cueros principalmente estïn formados por colïgenos que son susceptibles a la degradaciïn por proteasa, hay un riesgo de daïo del grano a la piel o cuero cuando se usan proteasas. Ademïs, las proteasas pueden no ser capaces de eliminar el pelo completamente, dejando un resto no deseado y, potencialmente, un color desigual en las pieles o cueros.

Se necesitan esfuerzos continuos para diseïar una enzima ideal para la eliminaciïn de pelo, que proporcione suficiente eliminaciïn del pelo y daïo mïnimo al cuero. Ademïs, tambiïn se desea la generaciïn de un proceso de ribera mïs respetuoso con el medio ambiente.

DESCRIPCIïN DETALLADA DE LA INVENCIïN

Un aspecto de la presente invenciïn es el uso de una glutamil endopeptidasa para pelos dïbiles en pieles y/o cueros, que produce la eliminaciïn mejorada de pelo, raïces capilares y papilas capilares en el cuero.

Otro aspecto de la presente invenciïn es un proceso de ribera modificado, que incluye un paso de eliminaciïn de pelo de glutamil endopeptidasa. El proceso modificado reduce el tiempo de procesamiento y tambiïn permite la reducciïn o invalidaciïn de productos quïmicos contaminantes tales como sulfuro y cal.

Definiciones [0010] El tïrmino " glutamil endopeptidasa " se refiere a una peptidasa, preferiblemente una serina endopeptidasa que corta en el lado carboxi terminal de un residuo de ïcido glutïmico y hasta cierto punto de un residuo de ïcido aspïrtico dependiendo del tampïn. Las peptidasas clasificadas como enzimas EC 3.4.21.19 o como enzimas EC 3.4.21.82 son glutamil endopeptidasas. Las enzimas clasificadas fuera de estas clases EC pueden ser tambiïn, no obstante, glutamil endopeptidasa. Se puede evaluar si una peptidasa es una glutamil endopeptidasa probando su preferencia para quebrantar Glu-|-Xaa en comparaciïn con Non-Glu-|-Xaa. Una prueba de cribado para identificar si una serina endopeptidasa es una glutamil endopeptidasa adecuada para esta invenciïn se describe en el mïtodo del Ejemplo 1. Este ensayo es tambiïn adecuado para identificar actividad de glutamil endopeptidasa.

El tïrmino "polipïptido aislado" se refiere a un polipïptido que es purificado por la mano humana con respecto al polipïptido encontrado en la naturaleza. En un aspecto, el polipïptido es al menos un 1 % puro, por ejemplo al menos un 5 % puro, al menos un 10 % puro, al menos un 20 % puro, al menos un 40 % puro, al menos un 60 % puro, al menos un 80 % puro, y al menos un 90 % puro, como se determina por SDS-PAGE. Preferiblemente, el polipïptido aislado de la presente invenciïn es una peptidasa aislada.

El tïrmino "LVU" o "unidad Lïhlein-Volhard" es una mediciïn para la actividad de proteasa. Una LVU es la cantidad de enzima, que degrada 1, 725 mg de caseïna bajo las condiciones establecidas aquï (50 mg/ml de caseïna disuelta en agua, pH ajustado con NaOH a 8, 2, temperatura 37 ïC, pH 8, 2 y tiempo de reacciïn 60 minutos) . La reacciïn se detiene aïadiendo HCl y la caseïna no degradada se precipita con sulfato de sodio. El consumo de ïlcali (NaOH) en la retitulaciïn de un filtrado de muestra menos el consumo de ïlcali (NaOH) en la retitulaciïn de un filtrado vacïo es una medida directa de la actividad de proteasa. Cuanto mïs caseïna se degrada y por lo tanto no precipitable, mïs NaOH se necesita en la retrotitulaciïn. (A. Kïntzel: Gerbereichemisches Taschenbuch, 6ï ediciïn, pïg. 85, Dresde y Leipzig, Alemania, 1955) .

El tïrmino "polipïptido maduro" se refiere a un polipïptido en su forma final despuïs de la traducciïn y de cualquier modificaciïn post-traduccional, tal como el procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilaciïn, fosforilaciïn, etc. El polipïptido maduro puede variar dependiendo del huïsped en el que estï expresado. En un aspecto, el polipïptido maduro son los aminoïcidos de 95 a 316 de SEC ID nï: 1 o aminoïcidos de 89 a 303 de SEC ID nï: 2 o aminoïcidos de 94 a 313 de SEC ID nï: 3 o aminoïcidos de 93 a 314 de SEC ID nï: 4 o aminoïcidos de 69 a 288 de SEC ID nï: 5 o aminoïcidos de 69 a 336 de SEC ID nï: 5, aminoïcidos de 121 a 342 de SEC ID nï: 6, ïcidos de 97 a 318 de SEC ID nï: 7 o aminoïcidos de 169 a 355 de SEC ID NO:8.

El tïrmino "identidad de secuencias" como se utiliza en este caso describe la relaciïn entre dos secuencias de aminoïcidos. Para fines de la presente invenciïn, el grado de identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoïcidos es determinado utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48: 443-453) como se implementï en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 16: 276-277) , preferiblemente la versiïn 3.0.0

o posterior. Los parïmetros opcionales usados son penalizaciïn abierta de gap de 10, penalizaciïn de extensiïn de gap de 0.5, y la matriz de sustituciïn EBLOSUM62 (versiïn de EMBOSS de BLOSUM62) . La salida de Needle calificada como "identidad mïs larga"... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo para debilitar el pelo en pieles que comprende el tratamiento de cueros o pieles con una cantidad eficaz de glutamil endopeptidasa en una soluciïn acuosa.

2. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, donde el pH de la soluciïn estï en la gama de 5, 5 a 12, 5, preferiblemente en la gama de 6 a 12, mïs preferiblemente en la gama de 6, 5 a 11, mïs preferiblemente en la gama de 7 a 10, mïs preferiblemente en la gama de 7, 5 a 9, 5, de la forma mïs preferible en la gama de 8 a 9.

3. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1 o 2, donde el tratamiento de glutamil endopeptidasa se realiza en el margen de pH de 5, 5 a 10, seguido de un aumento gradual en pH hasta por encima de 11.

4. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el tratamiento de glutamil endopeptidasa es realizado entre 1 y 5 horas, preferiblemente entre 1, 5 y 4 horas, mïs preferiblemente entre 2 y 3 horas y de la forma mïs preferible entre 1, 5 y 2, 5 horas.

5. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el tratamiento se realiza en presencia de una proteasa, preferiblemente de una serina proteasa (EC 3.4.21) .

6. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, donde el tratamiento se realiza con glutamil endopeptidasa como la ïnica fuente de actividad de proteasa.

7. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la glutamil endopeptidasa tiene una proporciïn de glutamil endopeptidasa de al menos 10.

8. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la glutamil endopeptidasa es derivada de una bacteria del gïnero Bacillus.

9. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la glutamil endopeptidasa es seleccionada entre polipïptidos con actividad de glutamil endopeptidasa y que comprende una secuencia con al menos 60 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 65 %, mïs preferido al menos 70 %, mïs preferido al menos 75 %, mïs preferido al menos 80 %, mïs preferido al menos 85 %, mïs preferido al menos 90 %, mïs preferido al menos 95 %, mïs preferido al menos 96 %, mïs preferido al menos 97 %, mïs preferido al menos 98 %, mïs preferido al menos 99 % de identidad con la secuencia al polipïptido maduro de una de SEC ID nï: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8.

10. Proceso para eliminaciïn de pelo de cueros o de pieles que incluye los pasos:

a) tratar cueros con una cantidad eficaz de alfa-amilasa en una soluciïn acuosa; y b) debilitar el pelo con una cantidad eficaz de glutamil endopeptidasa en una soluciïn acuosa.

11. Proceso segïn la reivindicaciïn 10, donde el tratamiento de alfa-amilasa en el paso a) se realiza en entre 1 y 6 horas.

12. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 11, donde el tratamiento de alfa-amilasa en el paso a) es un paso de remojo.

13. Proceso segïn la reivindicaciïn 12, donde el remojo se realiza entre 1 y 5 horas, preferiblemente entre 1, 5 y 5 horas, incluso mïs preferiblemente entre 1 y 4 horas, y de la forma mïs preferible alrededor d.

2. 3 horas.

14. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 13 donde el tratamiento de alfa-amilasa en el paso a) se realiza en la presencia de una proteasa, preferiblemente de una serina proteasa (EC 3.4.21) .

15. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 14, donde el debilitamiento de pelo en el paso b) se realiza segïn cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 8.

16. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 15, donde la piel obtenida despuïs del paso b) segïn la reivindicaciïn 10 es sometida a un tratamiento sulfïrico o tratamiento con un compuesto de reducciïn de disulfuro de proteïna alternativa.

17. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 16 donde la piel obtenida despuïs del paso b) se descarna y divide antes del tratamiento con sulfuro o un compuesto de reducciïn de disulfuro de proteïna alternativa.

18. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 16 o 17, donde el sulfuro se usa en la gama de 0, 1 % a 1.5 % por kg de piel.

19. Proceso segïn cualquiera de las reivindicaciones de 16 a 18, donde el tratamiento sulfïrico se realiza en combinaciïn con un agente de encalado.

20. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 19, donde el agente de encalado se usa en la gama de 0, 1 % a 2, 5 % por kg de piel.

21. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 15, donde el pelo es debilitado o eliminado sin el uso de sulfuro.

22. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 15 o 21, donde el pelo es debilitado o eliminado sin ningïn agente de encalado.

23. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 22, donde la piel obtenida despuïs del paso b) segïn la reivindicaciïn 10 es sometida a un paso mecïnico de eliminaciïn de pelo.

24. Proceso para preparar un wet blue que comprende los pasos siguientes:

a) un remojo para eliminar la suciedad; b) un remojo que comprende una alfa-amilasa y potencialmente una proteasa; c) eliminaciïn de pelo con una cantidad eficaz de glutamil endopeptidasa en una soluciïn acuosa; d) descarnado y divisiïn de la piel obtenida en c) e) desencalado; y f) piquelado y curtido.

25. Proceso segïn la reivindicaciïn 24, donde un tratamiento con un agente de encalado y/o sulfuro y/o o un compuesto de reducciïn de disulfuro de proteïna alternativa es introducido bien antes del paso d) o despuïs del paso d) .