PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR EN PLANTAS LA INFECCIÓN POR LOS VIRUS DE ARN DE CADENA SENCILLA QUE INFECTAN AL AJO OYDV, LYSV, GCLV, SLV, IYSV y ALLEXIVIRUS.

Procedimiento para detectar en plantas la infección por los virus de ARN de cadena sencilla que infectan al ajo seleccionados del grupo compuesto por los potyvirus Onion yellow dwarf virus (OYDV) y Leek yellow stripe virus (LYSV),

los carlavirus Garlic common latent virus (GCLV) y Shallot latent virus (SLV), el tospovirus Iris yellow spot virus (IYSV) y el Allexivirus, que comprende poner en contacto un material vegetal con sondas de ARN identificadas por SEQ ID NO: 1-6 y detectar la hibridación de dicha sonda con el contenido genético de dicho material vegetal, donde dicho material vegetal puede ser un extracto de ARN de ajo o improntas de dientes de ajo.

Procedimiento para detectar en plantas la infección por los virus de ARN de cadena sencilla que infectan al ajo OYDV, LYSV, GCLV, SLV, IYSV y Allexivirus.

CAMPO DE LA INVENCION El campo de la invención pertenece al sector agroalimentario y biotecnológico, con aplicaciones en diagnóstico y en el uso de herramientas moleculares para la detección de virus. La invención tambien esta relacionada con la agricultura, en particular con el cultivo de aliaceas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cultivo del ajo, Allium savitum L., puede estar infectado de forma natural, entre otros, por virus de los generos Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus, que se suelen encontrar en infecciones mixtas debido a la propagación vegetativa del ajo. En general hay pocos trabajos en los que se haya estudiado el efecto de cada virus por separado, sin embargo se sabe que los complejos virales pueden causar importantes perdidas de producción, con un efecto directo sobre el tamano de la cabeza de ajo, llegando hasta la reducción del 70% de su peso. Los virus mas destacables por las perdidas que producen en el rendimiento del cultivo son los potyvirus del enanismo amarillo de la cebolla (Onion yellow dwarf virus, OYDV) y del estriado amarillo del puerro (Leek yellow stripe virus, LYSV) . Las perdidas en producción pueden alcanzar valores entre el 39 y 60% para OYDV y entre el 17 y 54% para LYSV. Los carlavirus en general causan infecciones latentes aunque en infecciones mixtas pueden aumentar la gravedad de la enfermedad causada por los otros virus. En algunos casos se han encontrado infecciones mixtas de potyvirus con el carlavirus latente comun del ajo (Garlic common latent virus, GCLV) por lo que la estima de las perdidas ocasionadas por cada virus en particular puede no ser del todo correcta. El miembro mejor caracterizado del grupo de los carlavirus, que tambien esta presente en el cultivo del ajo, es el virus latente de la chalota (Shallot latent virus, SLV) . Para complicar aun mas el panorama, en el ano 2005 se detect6 por primera vez en Espana, en cultivo de cebolla, el Tospovirus de la mancha amarilla del Iris (Iris yellow spot virus, IYSV) , que esta incluido en la lista de alerta de la Organización Europea y Mediterranea para la Protección de las Plantas (EPPO) . Todos estos virus son de dificil control, y en general las medidas empleadas son preventivas para evitar que aparezcan en el cultivo. Los potyvirus y carlavirus se transmiten de forma no persistente por pulgones, y los allexivirus se transmiten por acaros. IYSV se trasmite por Thrips tabaci (trips de la cebolla) el cual esta ampliamente distribuido y su incidencia esta estrechamente relacionado con la incidencia del virus. El aumento de la incidencia de virus en el cultivo de ajo en Espana, con la consecuente merma en la producción del mismo, y las dificultades de control, han hecho necesario el desarrollo de tecnicas de detección masivas, rapidas y fiables que nos permitan determinar si las plantas en campo estan infectadas y con que virus. Evidentemente, es de especial importancia la detección de los virus que infectan el cultivo en las cabezas de ajo antes de plantar ya que asi se puede descartar el material contaminado y evitar que se produzca una infección primaria. El test ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) se ha empleado para la detección de virus de ajo. Esta tecnica permite realizar un analisis rapido de un gran numero de muestras, por lo que se ha seleccionado para el diagnóstico rutinario de virosis de ajo. Sin embargo no es aconsejable utilizarla para el analisis de plantas in vitro en su primera fase, obtenidas mediante cultivo de meristemos, puesto que la concentración viral en estas plantas se encuentra normalmente por debajo de los limites de detección de la tecnica. Hemos comprobado que la tecnica ELISA no siempre da lugar a resultados repetibles. Simplemente, el uso de sueros de diferentes casas comerciales puede dar lugar a la obtención de diferentes resultados con una misma muestra. Esto ha hecho que en la actualidad el test ELISA vaya sustituyendose por otras metodologias mas fiables. Una alternativa al test ELISA son las tecnicas basadas en la hibridación molecular que han sido empleadas anteriormente para la detección de otros virus. La detección por hibridación molecular se ha realizado fundamentalmente sobre extractos de acidos nucleicos totales o extractos de ARN total, en el caso de virus con genoma de ARN, pero tiene el inconveniente de que la preparación de los extractos requiere cierta labor y tiempo. Tambien se ha llevado a cabo sobre improntas de secciones de algun tejido de la planta en membranas de nylon lo cual evita realizar la extracción de acidos nucleicos totales (Narvaez V.G. et al. 2000. A new procedure to differentiate citrus tristeza virus isolates by hybridisation with digoxigenin-labelled cDNA probes. Journal of Virological Methods 85: 83-92) . DESCRIPCION DE LA INVENCION Una realización de la invención es un procedimiento para detectar en plantas la infección por al menos uno de los virus de ARN de cadena sencilla que infectan al ajo seleccionados del grupo compuesto por los potyvirus Onion yellow dwarf virus (OYDV) y Leek yellow stripe virus (LYSV) , los carlavirus Garlic common latent virus (GCLV) y Shallot latent virus (SLV) , el tospovirus Iris yellow spot virus (IYSV) y el Allexivirus, en adelante procedimiento de la invención, que comprende:

(a) poner en contacto un material vegetal con al menos una sonda de ARN identificada por una secuencia con al menos un 80% de identidad respecto a las secuencias seleccionadas del grupo compuesto por SEQ ID NO: 1-6 y

(b) detectar la hibridación de dicha sonda con el contenido genetico de dicho material vegetal, donde la presencia de hibridación constituye un resultado positivo de infección por dicho virus.

En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 80% de identidad significa que un 80% de residuos de la secuencia completa de las sondas de ARN identificadas por las secuencias SEQ ID NO: 1-6 son identicos a los residuos de la secuencia determinada.

En la presente solicitud se entiende por "material vegetal" a un material biológico obtenido de cualquier parte de una planta.

Una realización preferible de la invención es un procedimiento para detectar en plantas la infección por los virus de ARN de cadena sencilla que infectan al ajo: potyvirus Onion yellow dwarf virus (OYDV) y Leek yellow stripe virus (LYSV) , los carlavirus Garlic common latent virus (GCLV) y Shallot latent virus (SLV) , el tospovirus Iris yellow spot virus (IYSV) y el Allexivirus, que comprende:

(a) poner en contacto un material vegetal con las sondas de ARN identificadas por secuencias con al menos un 80% de identidad respecto a las secuencias SEQ ID NO: 1-6 y

(b) detectar la hibridación de dichas sondas con el contenido genetico de dicho material vegetal, donde la presencia de hibridación constituye un resultado positivo de infección por dicho virus.

El procedimiento de la invención proporciona un procedimiento para la detección de OYDV, LYSV, IYSV, SLV, GCLV y el grupo de los allexivirus basado en la hibridación molecular con sondas de ARN. El procedimiento es aplicable sobre extractos de ARN total y sobre improntas de secciones de tejidos de la planta y de secciones de diente de ajo. Este procedimiento presenta varias ventajas. Por una parte permite realizar en campo las impresiones del material vegetal a evaluar en membranas de nylon, las cuales se pueden guardar durante un tiempo sin riesgo de afectar a las muestras. Tras su llegada al laboratorio se procede a la unión de la muestra a la membrana mediante luz ultravioleta. Estas membranas se pueden conservar durante largos periodos de tiempo hasta su posterior hibridación. Una vez realizada la hibridación y los primeros lavados de las membranas, con los cuales se elimina la sonda que no ha hibridado con las muestras, existe la posibilidad de seguir con los lavados y el revelado de la membrana, o conservarla, tras su secado a temperatura ambiente, y continuar con el proceso posteriormente. La conservación de las membranas en distintos puntos del protocolo confiere una gran flexibilidad a este metodo.

Es muy recomendable realizar la detección en improntas de diente de ajo de las cabezas que se van a utilizar para establecer el nuevo cultivo y poder asi prevenir la infección. Estudios realizados en cebolla, iris y Hippeastrum han mostrado la distribución irregular de IYSV dentro de la planta y que el virus no se localiza en los bulbos de las plantas de cebolla infectadas sugiriendo que los bulbos de plantas de cebolla infectadas no sirven como fuente de in6culo de IYSV para la siguiente generación. Esto podria ocurrir igualmente en ajo, de manera que solamente...

1. Un procedimiento para detectar en plantas la infección por al menos uno de los virus de ARN de cadena sencilla que infectan al ajo seleccionados del grupo compuesto por los potyvirus Onion yellow dwarf virus (OYDV) y Leek yellow stripe virus (LYSV) , los carlavirus Garlic common latent virus (GCLV) y Shallot latent virus (SLV) , el tospovirus Iris yellow spot virus (IYSV) y el Allexivirus, caracterizado por que comprende:

(a) poner en contacto un material vegetal con al menos una sonda de ARN identificada por una secuencia con al menos un 80% de identidad respecto a las secuencias seleccionadas del grupo compuesto por SEQ ID NO: 1-6 y

(b) detectar la hibridación de dicha sonda con el contenido genetico de dicho material vegetal, donde la presencia de hibridación constituye un resultado positivo de infección por dicho virus.

2. Procedimiento segun la reivindicación 1, caracterizado por que dicho material vegetal procede de aliaceas.

3. Procedimiento segun la reivindicación 2, caracterizado por que dicha aliacea es ajo.

4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho material vegetal es un extracto obtenido de una planta o una impronta de secciones de tejido obtenido de una planta.

5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha sección de tejido es una sección de diente de ajo.

6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 4 6 5, caracterizado por que dicha impronta se imprime en membranas de nylon.

7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es 90%.

8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es 95%.

9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que dichas sondas de ARN estan identificadas por las secuencias seleccionadas del grupo compuesto por SEQ ID NO: 1-6.

10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dichas sondas de ARN estan unidas a una molecula trazadora.

11. Procedimiento segun la reivindicación 10, caracterizado por que dicha molecula trazadora esta seleccionada del grupo compuesto por digoxigenina, biotina y una molecula radiactiva.

12. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que en la etapa (a) dicho material vegetal se mantiene en contacto con dicha sonda de ARN a una temperatura de entre 65 y 70DC durante un tiempo de entre 6 y 16 horas.

13. Procedimiento segun la reivindicación 12, caracterizado por que dicha temperatura es 68DC y dicho tiempo es entre 12 y 14 horas.

14. Una construcción genetica que comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1-6.

15. Un cebador identificado por cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 7-18.