Detección mejorada de contaminación bacteriana (mollicutes).

Un procedimiento mejorado para determinar la presencia o la ausencia de un contaminante bacteriano en una muestra con material biológico,

contaminante bacteriano que se selecciona del grupo que consiste en Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma arginini, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma 5 fermentans, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirium, Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirium, procedimiento que comprende las etapas de

(a) procesar la muestra y purificar los ácidos nucleicos de la muestra procesada; seguido de

(b) formar una composición para una reacción de amplificación basada en PCR (mezcla de reacción), composición que incluye

- un primer cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:1,

- un segundo cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:2 y

- los ácidos nucleicos purificados de la etapa (a) o una fracción medida de los mismos como molde; seguido de (c) realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la composición de la etapa (b); seguido de

(d) detectar la presencia o la ausencia de una secuencia objetivo amplificada, en el que la presencia de dicha secuencia objetivo amplificada indica la presencia del contaminante bacteriano en la muestra y la ausencia de dicha secuencia objetivo amplificada indica la ausencia del contaminante bacteriano en la muestra;

mejora caracterizada por que en relación con el volumen de la muestra, se añade una cantidad predeterminada de ADN de células CHO a (i) la muestra o (ii) la muestra procesada de la etapa (a), o (iii) a los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (a), o (iv) a la composición de la etapa (b), de modo que el ADN de células CHO añadido reduce la amplificación inespecífica de la etapa (d).

Detección mejorada de contaminación bacteriana (mollicutes)

La presente invención proporciona una amplificación basada en PCR de una secuencia objetivo mejorada por la supresión de productos de amplificación inespecíficos. La mejora se refiere al uso de un par de cebadores optimizado para amplificar un ácido nucleico de un contaminante en el fondo del ADN genómico de un primer organismo. Cuando se somete el ADN de un segundo organismo que se sospecha que comprende el contaminante a la misma reacción de amplificación basada en PCR, se potencian la sensibilidad y la especificidad de la detección del contaminante cuando hay una cantidad de ADN genómico del primer organismo en la reacción de amplificación.

Antecedentes de la invención

El de los micoplasmas es un género de bacterias pertenecientes a la clase de los mollicutes que carecen de pared celular. Sin pared celular, las bacterias micoplasmas no sufren los efectos de muchos antibióticos comunes, tales como la penicilina o los antibióticos de beta-lactama dirigidos a la síntesis de la pared celular procariota. Existen más de 1 especies reconocidas del género de los micoplasmas, uno de los varios géneros de los mollicutes. Los mollicutes son parásitos o comensales de los seres humanos, de otros animales (incluidos insectos) y plantas; por definición, el género de los micoplasmas se limita a huéspedes vertebrados. El colesterol es necesario para la proliferación de las especies del género de los micoplasmas, así como de determinados otros géneros de mollicutes. Con frecuencia, su temperatura de proliferación óptima es la temperatura de su huésped, si es homeotermo (p. ej., 37 °C en los seres humanos) o la temperatura ambiente si el huésped no es capaz de regular su propia temperatura interna. El análisis de secuencias de ARN ribosómico 16S, así como del contenido génico apuntan muy claramente a que los mollicutes, incluidos los micoplasmas, están estrechamente relacionados con la rama de los lactobacilos o la de los clostridios del árbol filogenético (firmicutes, en sentido estricto).

Con frecuencia, se encuentran especies de micoplasmas en los laboratorios de investigación como contaminantes de cultivos celulares. La contaminación de cultivos celulares por micoplasmas se puede producir debido a la contaminación derivada de individuos o por ingredientes del medio de cultivo celular contaminados. Las células de micoplasmas son físicamente pequeñas (menos de 1 pm) y, por lo tanto, es difícil detectarlas con un microscopio convencional. Los micoplasmas pueden inducir cambios celulares, incluidas anomalías cromosómicas, y cambios en el metabolismo y el crecimiento celular. Las Infecciones graves por micoplasmas pueden destruir una estirpe celular.

Los micoplasmas también participan como patógenos en una serie de enfermedades. Mycoplasma pneumoniae es el principal agente causante de la neumonía extrahospitalaria. Recientemente se han relacionado especies de espiroplasmas con las encefalopatías espongiformes trasmlslbles (EET) por estudios moleculares y serológicos (Bastían, F.O., J Neuropathol Exp Neurol 64 (25) 833-838). Sin embargo, la asociación de las especies de espiroplasmas con las EET es aún controvertida, p. ej., en vista del fracaso de un estudio enmascarado de especies de ARNr para detectar cualquier rastro de espiroplasmas en el cerebro de hámsteres Infectados con la encefalopatía espongiforme ovina (Alexeeva, I., et al., J Clin Microbiol 44 (26) 91-97). No obstante, las EET en cuestión incluyen la encefalopatía espongiforme en ovejas, la enfermedad consuntiva crónica (ECC) en ciervos y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en seres humanos. Los aislados de especies de espiroplasmas obtenidos de cerebros de ovejas afectadas por la encefalopatía espongiforme ovina y de cerebros de ciervos afectados por la ECC Inoculados por vía intracraneal en ovejas y cabras indujeron una encefalopatía espongiforme con un gran parecido a la EET natural en estos animales. Aparentemente, estos datos demuestran que los espiroplasmas están asociados con la EET.

Se demostró que las bacterias espiroplasmas proliferan en huevos embrlonados y que se pueden pasar en un sistema de cultivo de ese tipo (Bastían, F.O., et al., Journal of Medical Mlcroblology 56 (27) 1235-1242).

Los huevos embrionados desempeñan un papel importante en la producción de las vacunas. Por ejemplo, las vacunas humanas contra la gripe llevan disponibles casi 6 años y, hasta hace poco, se preparaban casi en su totalidad a partir de virus cultivados en la cavidad alantoidea de huevos de gallina embrionados de 9 a 11 días. Por tanto, el potencial patógeno de los espiroplasmas hace de la detección de un patógeno de los mollicutes una herramienta de importancia primordial para garantizar la seguridad de todos los productos preparados a partir de huevos embrionados.

Por otro lado, la posibilidad de la contaminación por micoplasmas durante la producción blofarmacéutlca, el tratamiento celular y la ingeniería tisular es un problema importante en particular. En los procedimientos de detección tradicionales, exigidos por las farmacopeas y los reguladores de fármacos de todo el mundo, se usa la proliferación en medios de cultivo para identificar los organismos contaminantes. Estas técnicas basadas en cultivos requieren mucho tiempo para obtener resultados. Además, el cultivo de determinadas especies de micoplasmas puede no ser posible o fiable. Por lo tanto, son necesario ensayos microbianos mejorados y, en particular, más rápidos y fiables.

Eldering, J.A., et al., Biologicals 32 (24) 183-193 divulgan un procedimiento de PCR para analizar micoplasmas en cultivos de células de ovario de hámster chino. El principio de la prueba es, en primer lugar, aislar el ADN genómico

a partir de un cultivo celular (células y sobrenadante) y, en segundo lugar, realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos para una región del gen del ARNr 16S de especies de micoplasmas y el ADN aislado como molde. En caso de un resultado positivo, se forma y se detecta un producto de amplificación correspondiente a la región objetivo. Se obtiene un resultado negativo cuando no se forman productos de amplificación.

Los cebadores usados en el procedimiento son cebadores universales de micoplasmas que se han publicado anteriormente (Wong-Lee, J.G. y Lovett, M., "Rapid and sensitive PCR method for Identification of Mycoplasma species in tissue culture" en: Diagnostic molecular microbiology - principies and applications; Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ (editores), Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257-26). El procedimiento de Eldering, J.A., et al. (más arriba) es el resultado de la optimización de los ensayos y combina seis elementos que mejoran la sensibilidad y la especificidad de la detección de micoplasmas: (1) un plásmido de control positivo para un producto de PCR con un tamaño distinto en comparación con los amplificados del genoma de un micoplasma, (2) la purificación y la concentración del aislado de ADN a partir de los cultivos celulares que se sospecha que están contaminados con bacterias micoplasmas, (3) el uso de una polimerasa de ADN Taq de arranque en caliente, (4) el uso de una técnica de PCR llamada touchdown, en la que se aplica un gradiente de temperatura de alineación de 7 a 6 °C, (5) la descontaminación de los reactivos de PCR y (6) el uso de equipos y materiales específicos.

Cabe destacar que, con respecto al elemento (2) de dicho procedimiento de PCR optimizado, los autores seleccionaron un procedimiento para la purificación y la concentración de ADN que comprendía las etapas de (a) Usar el cultivo celular (células y medio) y (b) precipitar el ADN a partir del Usado con etanol y aislar el ADN precipitado.

Se divulga además que un procedimiento de precipitación de ese tipo resulta ventajoso con respecto a un procedimiento alternativo para la purificación de ADN usando columnas centrifugadoras. Típicamente, las columnas centrifugadoras contienen un material de filtro con una superficie de sílice. El ADN disuelto en un tampón rico en sales y/o caotrópico que, opcionalmente, contiene también un alcohol, se une al material de filtro al pasar el tampón a través de la columna centrifugadora, p. ej., a modo de centrifugación. En una etapa posterior se puede eluir el ADN del material de filtro con el uso de un tampón no caotrópico pobre en sales o agua pura. En el estudio de optimización se obtuvieron resultados que son coherentes con un contaminante minoritario que podría estar presente en las columnas centrifugadoras. Al poner las columnas en contacto con ADN genómico de CHO, se retiraron de las columnas centrifugadoras restos del contaminante. Se describió... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento mejorado para determinar la presencia o la ausencia de un contaminante bacteriano en una muestra con material biológico, contaminante bacteriano que se selecciona del grupo que consiste en Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma arginini, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma órale, Mycoplasma pirium, Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirium, procedimiento que comprende las etapas de

(a) procesar la muestra y purificar los ácidos nucleicos de la muestra procesada; seguido de

(b) formar una composición para una reacción de amplificación basada en PCR (mezcla de reacción), composición que incluye

- un primer cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:1,

- un segundo cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:2 y

- los ácidos nucleicos purificados de la etapa (a) o una fracción medida de los mismos como molde; seguido de

(c) realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la composición de la etapa (b); seguido de

(d) detectar la presencia o la ausencia de una secuencia objetivo amplificada, en el que la presencia de dicha secuencia objetivo amplificada indica la presencia del contaminante bacteriano en la muestra y la ausencia de dicha secuencia objetivo amplificada indica la ausencia del contaminante bacteriano en la muestra;

mejora caracterizada por que en relación con el volumen de la muestra, se añade una cantidad predeterminada de ADN de células CHO a (i) la muestra o (¡i) la muestra procesada de la etapa (a), o (iii) a los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (a), o (iv) a la composición de la etapa (b), de modo que el ADN de células CHO añadido reduce la amplificación inespecífica de la etapa (d).

2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración predeterminada de ADN por mi de la muestra líquida está en el intervalo de 1 mg por 1 mi de muestra a 25 mg por 1 mi de muestra.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la muestra líquida se selecciona del grupo que consiste en medio de cultivo celular con células cultivadas, sobrenadante de cultivo sin células y líquido amniótico.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la muestra líquida es líquido amniótico.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el líquido amniótico es de huevos embrionados.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa (d) la secuencia objetivo es un producto de amplificación específico con un tamaño en el intervalo de aproximadamente 1 pb a aproximadamente 15 pb.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el ADN de células CHO no tiene ADN procariota.

8. Una composición que comprende líquido alantoideo de huevos de gallina embrionados y ADN de células CHO.

9. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación 8, que comprende además un reactivo de lisis seleccionado de entre un agente caotrópico y una proteasa.

1. Una composición que comprende (i) ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra seleccionada del grupo que consiste en líquido amniótico, una suspensión de células eucariotas y un sobrenadante de una suspensión de células eucariotas, en la que las células eucariotas provienen de un ser humano o de una especie animal que no es el hámster chino, y (ii) ADN de células CHO que no tiene ADN procariota.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un primer cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:1, un segundo cebador de acuerdo con la SEQ NO:2, trifosfatos de nucleótidos y una polimerasa de ADN termoestable.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además un colorante intercalante.

13. Un kit que comprende, en recipientes separados, (i) un reactivo de lisis, (ii) ADN de células CHO purificado a una concentración predefinida, ADN que no tiene ADN procariota, y (iii) un primer cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:1 y un segundo cebador de acuerdo con la SEQ ID NO:2.

14. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para para amplificar el

ADN de un contaminante procariota a partir de ADN aislado de un muestra seleccionada del grupo que consiste en líquido amniótico, una suspensión de células eucariotas y un sobrenadante de una suspensión de células eucariotas.