Deleción de 3,4 kb en el ADN mitocondrial para uso en la detección de cáncer.

Un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende:

a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo;

b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt;

c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido;

en el que el cáncer es cáncer de mama.

Deleción de 3, 4 kb en el ADN mitocondrial para uso en la detección de cáncer

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud PCT no. PCT/CA2006/000652 presentada el 18 de abril, 2006 que reivindica prioridad de las solicitudes provisionales U.S. nos. 60/672, 016 presentada el 18 de abril, 2005, 60/721, 522 presentada el 29 de septiembre, 2005, y 60/789, 872 presentada el 7 de abril, 2006.

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de la genómica mitocondrial. En particular se refiere a una deleción de 3, 4 kb en el genoma mitocondrial y a su utilidad como un indicador del cáncer.

Descripción de la técnica anterior

ADN mitocondrial (ADNmt) como una herramienta de diagnóstico Las dinámicas de la secuencia del ADNmt son herramientas de diagnóstico importantes. Las mutaciones en el ADNmt son frecuentemente indicadores preliminares de una enfermedad en desarrollo, frecuentemente asociado con mutaciones nucleares, y actúan como biomarcadores relacionados específicamente con: enfermedad, tal como pero no limitado a, daño tisular y cáncer producidos por el tabaquismo y exposición pasiva a humo de tabaco (Lee et al., 1998; Wei, 1998) ; longevidad, basado en la acumulación de mutaciones en el genoma mitocondrial empezando aproximadamente a los 20 años de edad e incrementándose a partir de ahí (von Wurmb, 1998) ; enfermedad metastásica causada por mutación o exposición a carcinógenos, mutágenos, radiación ultravioleta (Birch-Machin, 2000) ; osteoartritis; enfermedad cardiovascular, de Alzheimer, de Parkinson (Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997;Zhang et al, 1998) ; pérdida auditiva asociada con la edad (Seidman et al., 1997) ; degeneración del nervio óptico y disrritmia cardiaca (Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988) ; exoftalmoplejía externa progresiva crónica (Taniike et al., 1992) ; aterosclerosis (Bogliolo et al., 1999) ; carcinomas tiroideos papilares y tumores tiroideos (Yeh et al., 2000) ; así como otros (por ejemplo, Naviaux, 1997; Chinner y y Turnbull, 1999) .

Las mutaciones en sitios específicos del genoma mitocondrial pueden asociarse con determinadas enfermedades. Por ejemplo, las mutaciones en las posiciones 4.216, 4.217 y 4.917 están asociadas con la Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) (Mitochondrial Research Society; Huoponen (2001) ; MitoMap) . Se encontró que una mutación en 15.452 en 5/5 pacientes estaba asociada con deficiencia en ubiquinol citocromo c reductasa (complejo III) (Valnot et al. 1999) .

Específicamente, estas mutaciones o alteraciones incluyen mutaciones puntuales (transiciones, transversiones) , deleciones (una base a miles de bases) , inversiones, duplicaciones, (una base a miles de bases) , recombinaciones e inserciones (una base a miles de bases) . Además, se ha encontrado que alteraciones de pares de bases específicos, deleciones o combinaciones de éstas estaban asociadas con el inicio temprano de cáncer de próstata, piel y pulmón, así como envejecimiento (por ejemplo Polyak et al., 1998) , envejecimiento prematuro, exposición a carcinógenos (Lee et al., 1998) , etc.

Cáncer de próstata El cáncer de próstata es un tumor sólido diagnosticado frecuentemente que lo más probablemente se origina en el epitelio de la próstata (Huang et al. 1999) . En 1997, cerca de 10 millones de hombres americanos se cribaron para antígeno específico de la próstata (PSA) , cuya presencia sugiere cáncer de próstata (Woodwell, 1999) . De hecho, esto indica un número incluso mayor de hombres cribados por un examen rectal digital inicial (DRE) . En el mismo año, 31 millones de hombres se sometieron a un DRE (Woodwell, 1999) . Además, se estima que el número anual de casos diagnosticados de nuevas de cáncer de próstata en los Estados Unidos es 179.000 (Landis et al., 1999) . Es el segundo cáncer diagnosticado más comúnmente y la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en los hombres canadienses. En 1997 el cáncer de próstata representó 19.800 de los cánceres diagnosticados de nuevas en los hombres canadienses (28%) (National Cancer Institute of Canada) . Se estima que 30% a 40% de todos los hombres por encima de la edad de cuarenta y nueve (49) tienen algunas células de la próstata cancerosas, pero sólo el 20% a 25% de estos hombres tienen una forma clínicamente significativa de cáncer de próstata (SpringNet -CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm) . El cáncer de próstata presenta una amplia variedad de comportamiento histológico que implica factores tanto endógenos como exógenos, es decir, situaciones socioeconómicas, dieta, geografía, desequilibrio hormonal, historial familiar y constitución genética (Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998) . Aunque determinadas alteraciones en el ADNmt se han asociado previamente con el cáncer de próstata, existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección del cáncer de próstata.

Deleción de 3, 4kb en el ADNmt y la detección del cáncer de próstata.

En la solicitud PCT en tramitación del solicitante que presenta el no. de publicación WO/06/111029 se identificó una deleción de un segmento de 3.379 pb de ADNmt mediante la amplificación del genoma mitocondrial completo de tejido de próstata. Se determinó que la deleción de 3.379 pb (referida como la deleción de 3, 4 kb) estaba localizada entre los nucleótidos 10.744-14.124 del genoma mitocondrial. Se determinó que la detección de esta deleción podría usarse en el diagnóstico del cáncer de próstata cuando se ensayan muestras de tejido. WO 2006/111029 no enseña el uso de ADNmt que tiene la deleción objeto en la detección de cánceres distintos del cáncer de próstata.

La deleción de 3, 4 kb elimina todo o parte de los genes siguientes del genoma de ADNmt: (i) subunidad 4L de la NADH deshidrogenasa, (ii) subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa, (iii) subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa,

(iv) ARNt histidina, (v) ARNt serina2, y (vi) ARNt leucina2.

Cáncer de mama El cáncer de mama es un cáncer del tejido glandular de la mama y es la quinta causa más común de muerte por cáncer. En 2005, el cáncer de mama causó 502.000 muertes (7% de las muertes por cáncer; casi 1% de todas las muertes) en el mundo (Organización Mundial de la Salud Cancer Fact Sheet No. 297) . Entre las mujeres en el mundo, el cáncer de mama es el cáncer más común y la causa más común de muerte por cáncer (Organización Mundial de la Salud Cancer Fact Sheet No. 297) . Las deleciones y mutaciones del genoma mitocondrial en el cáncer de mama se investigaron en Zhu et al. (2004, Cancer detection and prevention, 28 (2) :119-26) , Tan Duan-Jun et al. (2002, Cancer Research, 62 (4) :972-6) y Parella et al. (2001, Cancer Research, 61 (20) :7623-6) . Por ejemplo, Zhu et al. publica una relación entre el cáncer de mama y un ADNmt que comprende una deleción de 4.576 pb en una deleción denominada común de 4.977 pb. La publicación también describe que no se encontró que dos deleciones más en esta deleción común, las deleciones de 3.938 pb y 4388 pb, se correlacionaran con cáncer de mama. Ninguno de estos documentos describe una deleción de aproximadamente 3.379 pb como un marcador para cáncer de mama. Aunque determinadas alteraciones en el ADNmt se han asociado previamente con el cáncer de mama, por ejemplo en Parrella et al. (Cancer Research: 61, 2001) , existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección del cáncer de mama.

Resumen de la invención En una realización, la presente invención proporciona un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende:

a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo;

b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt;

c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido;

en el que el cáncer es cáncer de mama.

En una realización, el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.

En una realización adicional, el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.

En otra realización, el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido, en el que una cantidad elevada de la deleción en... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende: a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del

genoma de ADNmt; c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido;

en el que el cáncer es cáncer de mama.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido,

en el que una cantidad elevada de la deleción en la muestra biológica comparada con la muestra de referencia es indicativa de cáncer.

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido,

en el que un nivel similar de la deleción en la muestra biológica comparado con la muestra de referencia es indicativo de cáncer.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.

8. Un método para monitorizar a un individuo para el desarrollo de un cáncer que comprende: a) extraer ADNmt de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares

de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt; c) repetir las etapas a) a b) durante una duración de tiempo, en el que un nivel incrementado de la deleción durante la duración de tiempo es indicativo de cáncer; en el que el cáncer es cáncer de mama.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en: (a) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido; y (b) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la deleción tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia identificada en SEQ ID NO: 1.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cuantificación de la deleción incluye en primer lugar amplificar una región diana de ADNmt que es indicativa de la deleción, y cuantificar la cantidad de la región diana amplificada.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la amplificación de la región diana se lleva a cabo usando una pareja de cebadores de amplificación, uno de la pareja de cebadores de amplificación que se superpone con un empalme que une las regiones en extremos opuestos de la deleción.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de cuantificación se lleva a 5 cabo usando PCR en tiempo real.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de cuantificación se lleva a cabo usando PCR en tiempo real y en el que el valor de referencia es un umbral de ciclo.

15. El método de la reivindicación 11 ó 14, en el que se usa un cebador de PCR que tiene una secuencia

correspondiente a SEQ ID NO: 2 como parte de una pareja de cebadores de amplificación para amplificar la región 10 diana.

16. El método de la reivindicación 11 ó 14, en el que uno de una pareja de cebadores de PCR usado en la amplificación de la región diana se superpone con una región con empalme de ADNmt después de la deleción de la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica es un tejido 15 corporal o fluido corporal.

18. El método de la reivindicación 17, en el que la muestra biológica se selecciona de tejido de mama y orina.