Defectos de genes y quinasa ALK mutante en tumores sólidos humanos.

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de EML4-ALK,

comprendiendo dicha secuencia de polinucleótidos una secuencia de nucleótidos idéntica en el menos 90% a la secuencia de nucleótidos de la Fig. 2A o una secuencia de polinucleótido complementaria de la misma.

Defectos de genes y quinasa ALK mutante en tumores sólidos humanos Campo de la invención La invención se refiere en general a proteínas y genes implicados en el cáncer, y a la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención Muchos cánceres se caracterizan por alteraciones en las vías de señalización celular que conducen a un control aberrante de los procesos celulares, o al crecimiento y proliferación incontrolados de las células. Estas alteraciones son causadas a menudo por los cambios en la actividad de proteínas de señalización concretas, tales como las quinasas. Entre estos cánceres se encuentran tumores sólidos, como carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) . El CPCNP es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, y representa aproximadamente 87% de todos los cánceres de pulmón. Existen aproximadamente 151.000 nuevos casos de CPCNP en los Estados Unidos cada año, y se estima que más de 120.000 pacientes morirán anualmente a causa de esta enfermedad solo en los Estados Unidos. Véase "Cancer Facts and Figures 2005", American Cancer Society. El CPCNP, que comprende tres subtipos distintos, a menudo solo se detecta después de que haya metastatizado, y por lo tanto la tasa de mortalidad es de 75% en los dos años siguientes al diagnóstico.

Se sabe que las deleciones y/o translocaciones génicas que dan como resultado proteínas de fusión de quinasas con actividad de señalización aberrante pueden conducir directamente a ciertos cánceres. Por ejemplo, se ha demostrado directamente que la oncoproteína BCR-ABL, una proteína de fusión de tirosina quinasa, es el agente causal en la leucemia mielógena crónica humana (LMC) . La oncoproteína BCR-ABL, que se encuentra en al menos 90-95% de los casos de LMC, es generada por la translocación de secuencias génicas de la proteína tirosina quinasa c-Abl en el cromosoma 9 a las secuencias de BCR en el cromosoma 22, produciendo el denominado cromosoma Filadelfia. Véase, p. ej., Kurzock et al., N. Engl. J. Med. 319: 990-998 (1988) . La translocación se observa también en casos de leucemia linfocítica aguda y CPCNP.

Se han descrito translocaciones y deleciones génicas que conducen a proteínas mutantes o de fusión implicadas en una variedad de otros cánceres. Por ejemplo, Falini et al., Blood 99 (2) : 409-426 (2002) , revisan las translocaciones que se sabe que se producen en los cánceres hematológicos, incluyendo la fusión NPM-ALK encontrada en LACG. Hasta la fecha, se han descrito solo un número limitado de translocaciones, deleciones de genes, y proteínas mutantes que aparecen en los cánceres de pulmón, incluyendo la translocación t (15;19) que implica Notch3. Véase Dang et al., J. Natl. Can. Instit. 92 (16) : 1355-1357 (2000) . Se han encontrado defectos en la expresión y/o actividad de la Proteína 6 de Unión a ARN (EML-4) en carcinomas de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas. Véase. Drabkin et al., Oncogene 8 (16) : 2589-97 (1999) . Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito translocaciones o deleciones en el cáncer CPCNP humano que impliquen proteínas quinasas.

Se han descrito defectos en la expresión de la quinasa ALK resultante de la fusión de NPM a ALK en el linfoma anaplásico de células. Véanse Morris et al., 1994; Shiota et al., 1994. Se han descrito la fusión de ALK a moesina, a la cadena pesada 9 de la miosina no muscular (Tort et al. 2001) , a la cadena pesada de clartrina (Touriol et al., 2000; Bridge et al., 2001) , a tropomiosina 3 (TPM3) (Lamant et al., 1999) , al gen fusionado a TRK (TGF) (Hernández et al., Am. J. Path. 160 (4) : 1487-1493 (2002) ) y a otros genes. En particular, se informó sobre la fusión de TGF-ALK en el linfoma no sólido, pero hasta la fecha esta fusión no se ha descrito en los tumores sólidos. Se ha descrito el papel general de ALK en el cáncer. Véase Pulford et al., J. Cell Physiol. 199 (3) : 330-358 (2004) . Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito defectos en la expresión y/o activación de EML-4.

La identificación de mutaciones en cánceres humanos es altamente deseable, ya que puede conducir al desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que se dirigen a tales proteínas de fusión o mutantes, y a nuevos diagnósticos para la identificación de pacientes que tienen tales mutaciones genéticas. Por ejemplo, BCR-ABL se ha convertido en una diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de la leucemia. Más recientemente, Gleevec® (mesilato de imatinib, STI-571) , un inhibidor de molécula pequeña de la quinasa ABL, ha sido aprobado para el tratamiento de la LMC. Este fármaco es el primero de una nueva clase de agentes anti-proliferativos diseñados para interferir en las rutas de señalización que dirigen el crecimiento de células tumorales. El desarrollo de este fármaco representa un avance significativo sobre las terapias convencionales para la LMC y la LLA, la quimioterapia y la radiación, que se ven afectadas por los efectos secundarios bien conocidos y tienen a menudo un efecto limitado, ya que no pueden dirigirse específicamente a las causas subyacentes de las enfermedades malignas. Del mismo modo, se han descrito los reactivos y métodos para detectar específicamente la proteína de fusión BCR-ABL en pacientes, con el fin de identificar a los pacientes con más probabilidades de responder a inhibidores específicos, como Gleevec®.

Oyama et al. (2005) , Anticancer Research, International Institute of Anticancer Research, 25 (2B) , 1193-1196 comentan que se han examinado no solo los marcadores tumorales del suero, tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) , el antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC) y el antígeno carbohidrato (CA) 125, sino también los factores de crecimiento en suero para evaluar las fases del tumor y predecir la recurrencia y la

metástasis en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y que se han identificado una matriz de marcadores tumorales genéticos moleculares (MGTM) basándose en la caracterización biológica de los tumores, tales como el desarrollo, crecimiento, invasión y metástasis del tumor. Este artículo revisa los MGTM característicos del cáncer de pulmón y aclara la utilidad clínica y las aplicaciones de los MGTM para el tratamiento del cáncer.

Pulford et al. (2004) , Journal of Cellular Physiology, 199 (3) , 330-358 comentan las formas de fusión activadas de la tirosina quinasa ALK en el linfoma anaplásico de células grandes (LACG) y tumores inflamatorios miofibroblásticos. Se puede demostrar que la especificidad terapéutica de ALK tiene eficacia en el tratamiento de muchos de estos neoplasmas.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de la identificación de nuevas mutaciones de genes, tales como translocaciones o deleciones, que dan como resultado proteínas de fusión o mutantes implicadas en la progresión de cánceres humanos, concretamente tumores sólidos, incluyendo cánceres de pulmón como el CPCNP, y el desarrollo de nuevos reactivos y métodos para el estudio y la detección de tales proteínas de fusión. La identificación de tales proteínas de fusión permitirá deseablemente, entre otras cosas, nuevos métodos de selección de pacientes para terapias dirigidas, así como para el escrutinio de nuevos fármacos que inhiban tales proteínas mutantes/de fusión.

Compendio de la invención De acuerdo con la invención, se han identificado ahora mutaciones novedosas por deleción génica que se producen en el cromosoma humano 2 que dan como resultado proteínas de fusión que combinan parte de la Quinasa del Linfoma Anaplásico (ALK) con una proteína secundaria en el tumor sólido de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) humano. Las proteínas secundarias que participan en las fusiones de ALK incluyen Proteína de Tipo 4 Asociada a Microtúbulos de Equinodermo (EML-4) y Gen Fusionado a TRK (TFG) . Las quinasas ALK mutantes/de fusión han sido observadas en la actualidad en muestras de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas.

Por consiguiente, la invención proporciona, en parte, polinucleótidos aislados y vectores que codifican los polipéptidos de ALK mutantes/de fusión descritos, sondas y análisis para detectarlos, polipéptidos de ALK mutante/de fusión aislados, polipéptidos mutantes recombinantes, y reactivos para la detección de los polinucleótidos y polipéptidos de ALK mutantes. La identificación descrita de estas nuevas quinasas ALK mutantes y de las translocaciones/deleciones permite nuevos métodos para determinar la presencia de polinucleótidos o polipéptidos de ALK mutantes en una muestra biológica, métodos para el escrutinio de compuestos que inhiben la proteína quinasa mutante,... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de EML4-ALK, comprendiendo dicha secuencia de polinucleótidos una secuencia de nucleótidos idéntica en el menos 90% a la secuencia de nucleótidos de la Fig. 2A o una secuencia de polinucleótido complementaria de la misma.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido exhibe al menos una identidad de 95% con la secuencia de nucleótidos de la Fig. 2A.

3. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Figura 2A.

4. El polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polinucleótido 10 comprende la secuencia de nucleótidos de la Fig. 2A

5. El polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

6. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Una célula anfitriona que comprende el vector recombinante de la reivindicación 6.

8. Un método para preparar una célula anfitriona de la reivindicación 7, que comprende introducir un vector recombinante de la reivindicación 6 en una célula anfitriona.

9. Un método para producir un polipéptido de fusión de EML4-ALK recombinante, comprendiendo dicho método cultivar la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para la expresión 20 de dicho polipéptido de fusión y recuperar dicho polipéptido.

10. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2A.

11. Un polipéptido de EML4-ALK aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2A.

12. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a, o detecta, un polipéptido de fusión de EML4-ALK

de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, pero no se une a, o detecta, EML-4 de tipo salvaje o ALK de tipo salvaje.

13. Un método para detectar la presencia de un polinucleótido de ALK mutante en una muestra biológica de un cáncer de mamífero, comprendiendo dicho método:

detectar un polinucleótido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Un método para detectar la presencia de un polipéptido de ALK mutante en una muestra biológica de un cáncer de mamífero, comprendiendo dicho método:

detectar un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11 para determinar si un polipéptido mutante de ALK está presente en dicha muestra.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en donde dicho cáncer es un tumor sólido sarcoma o carcinoma. 35 16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho carcinoma es un carcinoma de pulmón.

17. El método de la reivindicación 16, en donde dicho carcinoma de pulmón es el carcinoma de pulmón de células no pequeñas.

18. El método de la reivindicación 14, en donde el polipéptido se detecta en un formato de análisis de citometría de flujo (FC) , inmunohistoquímica (IHC) , o inmunofluorescencia (IF) .

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el polipéptido se detecta utilizando un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.

20. El método de la reivindicación 13, en donde el polinucleótido se detecta en un formato de análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

21. El método de la reivindicación 14, en donde se detecta la actividad quinasa de dicho polipéptido de 45 fusión de ALK.

22. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en la inhibición de la progresión de un

carcinoma de pulmón de células no pequeñas mediante el bloqueo de la actividad de un polipéptido de ALK.

23. Un método para determinar si un compuesto inhibe la progresión de un cáncer caracterizado por la presencia de un polipéptido según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, comprendiendo dicho método la etapa de determinar si dicho compuesto inhibe la expresión y/o actividad de la quinasa de dicho polipéptido en dicho cáncer.