Construcciones de ácido nucleico y procedimientos de producción de composiciones de aceite de semillas alteradas.

Una semilla de soja que muestra una composición de ácidos grasos de aceite de la semilla que comprende un contenido de ácido oleico del 42 % al 85 % en peso de los ácidos grasos totales y un contenido de ácidos grasos saturados del 1,

5 % al 8 % en peso de los ácidos grasos totales, en la que dicha semilla comprende adicionalmente un genoma con una secuencia de ácido nucleico que comprende un fragmento de un intrón FAD2-1 de soja que es entre aproximadamente 20 y aproximadamente 420 nucleótidos contiguos de longitud y un fragmento de un gen FATB de soja que es entre aproximadamente 40 y aproximadamente 450 nucleótidos contiguos de longitud.

Construcciones de ácido nucleico y procedimientos de producción de composiciones de aceite de semillas alteradas

Se presentan con la presente una copia en papel del Listado de Secuencias y una forma legible por ordenador del listado de secuencias en disquete, que contiene el archivo llamado "Omn¡2 AS FILED.txt", que es de 60.690 bytes de tamaño (medido en MS-DOS) y que se registró el 25 de septiembre de 2003 y se presentó en la solicitud de Estados Unidos N° 10/669.888. Se presenta con la presente una copla en papel del Listado de Secuencias y una forma legible por ordenador del listado de secuencias en disquete, que contiene el archivo llamado "OmniChild.txt", que es de 61.434 bytes de tamaño (medido en MS-DOS) y que se registró el 15 de marzo de 2006.

Campo de la invención

La presente Invención se refiere a moléculas de ácido nucleico recombinantes, construcciones y otros agentes asociados con la manipulación coordinada de múltiples genes en la ruta de síntesis de ácidos grasos. En particular, los agentes de la presente invención están asociados con la expresión potenciada simultánea de ciertos genes en la ruta de síntesis de ácidos grasos y expresión suprimida de ciertos otros genes en la misma ruta. La presente invención también se refiere a plantas que Incorporan dichos agentes, y en particular a plantas que incorporan dichas construcciones donde las plantas muestran composiciones de aceite de semillas alteradas.

Antecedentes

Se usan aceites vegetales en una diversidad de aplicaciones. Son necesarias nuevas composiciones de aceites vegetales y enfoques mejorados para obtener composiciones de aceite, a partir de fuentes vegetales biosintéticas o naturales. Dependiendo del uso pretendido del aceite, se desean diversas composiciones de ácidos grasos diferentes. Las plantas, especialmente especies que sintetizan grandes cantidades de aceites en las semillas, son una fuente importante de aceites para usos tanto comestibles como industriales. Los aceites de semillas están compuestos casi completamente de triacilgliceroles en que los ácidos grasos están esterificados en los tres grupos hidroxilo de glicerol.

El aceite de soja típicamente contiene aproximadamente un 16-20 % de ácidos grasos saturados: un 13-16 % de palmitato y un 3-4 % de estearato. Véase en líneas generales Gunstone y col., The Lipid Handbook, Chapman y Hall, Londres (1994). Se han modificado aceites de soja por diversos procedimientos de cultivo para crear beneficios para mercados específicos. Sin embargo, no está disponible un aceite de soja que sea beneficioso en general para usuarios de aceite de soja importantes tales como consumidores de aceite de ensalada, aceite de cocinar y aceite de freír, y mercados industriales tales como los mercados del biodiesel y biolubricante. Los aceites de soja previos eran demasiado caros o carecían de una propiedad de calidad alimentaria importante tal como estabilidad oxidativa, buen sabor en alimentos fritos o contenido en grasas saturadas, o una importante propiedad de los biodiesel tal como emisiones de óxido nítrico apropiadas o tolerancia al frío o flujo en frío.

Las plantas superiores sintetizan ácidos grasos mediante una ruta metabólica común, la ruta de la ácido graso sintetasa (FAS), que está localizada en los plástidos. Las p-cetoacil-ACP sintasas son importantes enzimas limitantes de la velocidad en las FAS de células vegetales y existen en varias versiones. La p-cetoacil-ACP sintasa I cataliza la elongación de cadena hasta palmitoil-ACP (C16:0), mientras que la p-cetoacil-ACP sintasa II cataliza la elongación de cadena hasta estearoil-ACP (C18:0). La p-cetoacil-ACP sintasa IV es una variante de la p-cetoacil- ACP sintasa II y también puede catalizar la elongación de cadena hasta 18:0-ACP. En soja, los principales productos de FAS son 16:0-ACP y 18:0-ACP. La desaturación de 18:0-ACP para formar 18:1-ACP está cataliza por una delta-9 desaturasa soluble localizada en plástidos (también denominada "estearoil-ACP desaturasa"). Véase Voelker y col., 52Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 335-61 (2001).

Los productos de la FAS y delta-9 desaturasa de plástidos, 16:0-ACP, 18:0-ACP y 18:1-ACP, se hidrolizan por tioesterasas específicas (FAT). Las tioesterasas vegetales pueden clasificarse en dos familias de genes basándose en la homología de secuencia y preferencia de sustrato. La primera familia, FATA, incluye acil-ACP tioesterasas de cadena larga que tienen actividad principalmente sobre 18:1-ACP. Las enzimas de la segunda familia, FATB, utilizan habitualmente 16:0-ACP (palmitoil-ACP), 18:0-ACP (estearoil-ACP) y 18:1-ACP (oleoil-ACP). Dichas tioesterasas tienen un papel importante en la determinación de la longitud de cadena durante la biosíntesis de ácidos grasos de novo en plantas, y por tanto estas enzimas son útiles en la provisión de diversas modificaciones de composiciones de acilo grasas, particularmente con respecto a las proporciones relativas de diversos grupos acilo grasos que están presentes en aceites de almacenamiento de semillas.

Los productos de las reacciones de FATA y FATB, los ácidos grasos libres, dejan los plástidos y se convierten en sus respectivos acil-CoA ésteres. Los acil-CoA son sustratos para la ruta de la biosíntesis de lípidos (ruta de Kennedy), que está localizada en el retículo endoplásmico (RE). Esta ruta es responsable de la formación de lípidos de membrana así como de la síntesis de triacilgliceroles, que constituyen el aceite de las semillas. En el RE hay desaturasas unidas a membrana adicionales, que pueden desaturar adicionalmente 18:1 en ácidos grasos poliinsaturados. Una delta-12 desaturasa (FAD2) cataliza la inserción de un doble enlace en 18:1, formando ácido linoleico (18:2). Una delta-15 desaturasa (FAD3) cataliza la inserción de un doble enlace en 18:2, formando ácido

linolénico (18:3).

Muchas rutas bioquímicas complejas se han manipulado ahora genéticamente, habitualmente por supresión o sobreexpresión de genes individuales. La explotación adicional del potencial para manipulación genética vegetal requerirá la manipulación coordinada de múltiples genes en una ruta. Se han usado varios enfoques para combinar transgenes en una planta, incluyendo cruce sexual, retransformación, contransformación y el uso de transgenes ligados. Un transgén quimérico con secuencias génicas parciales ligadas puede usarse para suprimir de forma coordinada numerosos genes endógenos vegetales. Pueden usarse construcciones basadas en poliproteínas virales para introducir simultáneamente múltiples genes codificantes en células vegetales. Para una revisión, véase Halpin y col, Plant Mol. Biol. 47: 295-310 (2001).

El documento WO 03/080802 desvela plantas y semillas de soja que muestran un contenido particular de composición de ácidos grasos. Sin embargo, la publicación no desvela una semilla que muestre una composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla que comprenda un contenido de ácido oleico del 42 % al 85 % en peso de los ácidos grasos totales y un contenido de ácidos grasos saturados del 1,5 % al 8 % en peso de los ácidos grasos totales.

Todos los documentos WO 2004/001001, WO 01/79499, WO 2004/00871 y WO 2004/001000 desvelan diferentes procedimientos para suprimir genes implicados en la síntesis de ácidos grasos en cultivos de semillas oleaginosas de climas templados tales como soja o algodón. En los documentos WO 2004/001001 y WO 2004/001000 se suprimen FAD2 y FAD3, en el documento WO 01/79499 se suprimen la delta-9 desaturasa y FAD2 y en el documento WO 2004/00871 se suprimen FATB, FAD2 y beta-cetoacil-ACP sintasa. Ninguno de estos enfoques produjo semillas que muestren una composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla que comprenda un contenido de ácido oleico del 42 % al 85 % en peso de los ácidos grasos totales y un contenido de ácidos grasos saturados del 1,5 % al 8 % en peso de los ácidos grasos totales.

Por tanto, un fenotipo de planta deseado puede requerir la expresión de uno o más genes y la reducción simultánea de la expresión de otro gen u otros genes. Por tanto, existe la necesidad de sobreexpresar simultáneamente uno o más genes y suprimir, o regular negativamente, la expresión de otro gen o genes en plantas usando una única construcción transgénica.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona semillas de soja que muestran una composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla que comprende un contenido de ácido oleico del 42 % al 85 % en peso de los ácidos grasos totales y un contenido de ácidos grasos saturados del 1,5 % al 8 % en peso de los ácidos grasos totales, en las que dichas semillas comprenden además un genoma con una secuencia de ácido nucleico que comprende... [Seguir leyendo]

1. Una semilla de soja que muestra una composición de ácidos grasos de aceite de la semilla que comprende un contenido de ácido oleico del 42 % al 85 % en peso de los ácidos grasos totales y un contenido de ácidos grasos saturados del 1,5 % al 8 % en peso de los ácidos grasos totales, en la que dicha semilla comprende adicionalmente

un genoma con una secuencia de ácido nucleico que comprende un fragmento de un intrón FAD2-1 de soja que es entre aproximadamente 20 y aproximadamente 420 nucleótidos contiguos de longitud y un fragmento de un gen FATB de soja que es entre aproximadamente 40 y aproximadamente 450 nucleótidos contiguos de longitud.

2. Una semilla de soja de acuerdo con la reivindicación 1, que muestra una composición de aceite que comprende de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 80 % en peso de ácido oleico, aproximadamente un 8 % a

aproximadamente un 1,5 % en peso de ácidos grasos saturados, aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 45 % en peso de ácido linoleico, aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 14 % en peso de ácido linolénico, en la que una cantidad combinada del ácido oleico y el ácido linolénico es de aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 90 % en peso de la composición total de aceite, y la semilla comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ADN que comprende un fragmento del intrón FAD2-1 que 15 es entre aproximadamente 50 y aproximadamente 400 nucleótidos contiguos de longitud, una región codificante de péptido de tránsito en cloroplastos FATB, y 42 nucleótidos contiguos de una UTR 5' de FATB.

3. Un procedimiento de producción de una composición de aceite que comprende producir semillas de soja de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y procesar la semilla para producir el aceite.