Conjugado entre una fase sólida tiofílica y un oligonucleótido que comprende un tiooxonucleótido.

Conjugado de oligonucleótido-fase sólida, en el que la fase sólida comprende un metal tiofílico,

en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:**Fórmula**

en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2, en la que --- indica un enlace covalente, y en el que dicho oligonucleótido se une a dicha fase sólida mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido.

Conjugado entre una fase sólida tiofílica y un oligonucleótido que comprende un tiooxonucleótido Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un conjugado de oligonucleótido-fase sólida, en el que la fase sólida es tiofílica, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:

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en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2, en la que Indica un enlace covalente, y en el que dicho oligonucleótido se une a dicha fase sólida mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido. Da a conocer además un método para producir dicho conjugado, así como diversos usos para dicho conjugado de oligonucleótido- metal.

La conjugación de blomoléculas con superficies sólidas es una etapa crucial, por ejemplo en muchas aplicaciones diagnósticas, tales como en un ¡nmunoensayo o en una matriz de ácidos nucleicos, requiriendo ambos la unión de una blomolécula a una fase sólida. Se encuentran disponibles materiales bastante diferentes de fase sólida para las diversas aplicaciones diferentes, tales como las superficies o partículas de poliestireno o látex, aunque también superficies recubiertas de metal, partículas metálicas y puntos cuánticos, entre otros.

Entre las nanopartículas metálicas accesibles, los puntos cuánticos y las nanopartículas de oro (NPAu) han ganado particular atención debido a que son químicamente inertes y la facilidad de modificación superficial (Mitchell, G.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 121:8122-8123, 1999; Mahtab, R. etal., J. Am. Chem. Soc. 117:999-91, 1995; Mahtab, R. etal., J. Am. Chem. Soc. 122:14-17, 2; Reynolds III, R.A. etal., Puré Appl. Chem. 72:229-235, 2; Thanh, N.T. et al., Anal. Chem. 74:1624-1628, 22; Csáki, A. et al., Exp. Rev. Mol. Diagn. 2:187-193, 22; Thaxton, C.S. y Mirkin, C.A., en: Nanobiotechnology, Niemeyer, C.M. y Mirkin, C.A. (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, páginas 288 a 37, 24).

Resulta posible, por ejemplo, acoplar ADN a nanopartículas de oro. El sistema de conjugados de ADN- nanopartículas de oro (ADN-NPAu) combina las propiedades favorables de los coloides de oro con las del ADN. La molécula de ADN presenta (i) propiedades de reconocimiento molecular únicas, (ii) resulta fácilmente accesible por la síntesis automática de ADN o la polimerización enzimática, (iii) los oligonucleótidos de cadena sencilla presentan la capacidad de formar agregados multicadena, permitiendo la construcción de dispositivos a nanoescala (Seeman, N.C., Nature 421:427-431, 23; Niemeyer, C.M., Curr. Opin. Chem. Biol. 4:69-618, 2; Gothelf, K.V. etal., Org. Biom. Chem. 3:423-437, 25; Seela, F. y Budow, S., Helv. Chim. Acta 89:1978-1985, 26; Seela, F. etal., Org. Biomol. Chem. 5:1858-1872, 27; Seela, F. et al., Chem. Biodiv. 2:84-91, 25).

Las nanopartículas de oro o las superficies de oro que han sido funcionalizadas con oligonucleótidos son elementos cruciales para diferentes aplicaciones, por ejemplo para biosensores utilizados para diagnósticos in vitro, para la obtención de imágenes in vivo, como portador de fármacos, y para construir nanoestructuras definidas. Existe una literatura extensiva sobre la utilización de conjugados de oligonucleótidos y oro, que se revisa parcialmente en: Letsinger, R.L. et al., Chemistry of Oligonucleotide -Gold Nanoparticle Conjugates, en: Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, Vol. 144-146, páginas 359 a 362, 1999; Ingenious nanoprobes in bioassays, Chan, Cangel Pui-yee, Bioanalysis 11:5-133, 29; y Biosensors based on gold nanoparticle labeling, Moeller, R., Annual Review of Nano Research 1:429-466, 26.

La facilidad de producción de un oligonucleótido de interés y la robusta química de la conjugación de dichos oligonucleótidos con, por ejemplo, una partícula de oro, es la base que presta apoyo al amplio abanico de aplicaciones de las partículas de oro recubiertas con oligonucleótidos.

El protocolo convencional para la unión de oligonucleótidos a superficies de nanopartículas de oro (NPAu) utiliza oligonucleótidos modificados en los extremos 5' ó 3' con un grupo tiol (Mirkin C.A. et al., Nature 382:67, 1996). Los oligonucleótidos de cadena sencilla se funcionalizan en su extremo 5' ó 3', respectivamente, con conectores acíclicos que portan grupos tiol. A continuación se utiliza la función tiol para la inmovilización covalente con las

NPAu. Sin embargo, dicha modificación, tras la síntesis de oligonucleótidos, requiere una etapa adicional de acoplamiento/manipulación.

Determinados otros métodos de conjugación de oligonucleótidos con superficies de nanopartículas de oro (NPAu) se basan en la utilización de oligonucleótidos con modificación de tiol. En estos métodos, se introducen grupos tiol durante la síntesis de los oligonucleótidos mediante la utilización de fosforamiditas "modificadoras de tiol", las cuales se encuentran disponibles comercialmente. El grupo tiol se protege con un grupo tritilo que requiere condiciones de desprotección especiales utilizando nitrato de plata o se protege como disulfuro que se corta mediante reducción con DTT. En ambos casos, las condiciones de desprotección estándares no resultan adecuadas y debe eliminarse por completo el exceso de dichos reactivos de desprotección especiales antes de la unión de los oligonucleótidos a la superficie de oro.

En lugar de la síntesis química de un oligonucleótido también resulta posible una síntesis enzimática. Ninguna de las fosforamiditas modificadoras de tiol es compatible con la Incorporación enzimática en un oligonucleótido.

Para la incorporación enzimática de grupos reactivos de oro, se utiliza el compuesto 4-tlo-tlmldlna trifosfato (4- tioTTP) (Incorporation of DNA networks into microelectrode structures; Erler, C. and Mertig, M., Journal of Vacuum Science & Technology, B: Microelectronics and Nanometer Structures-Processing, Measurement, and Phenomena 27:939-943, 29).

La 4 Tío T fosforamidita correspondiente se encuentra disponible comerclalmente y puede utilizarse en la síntesis química de un oligonucleótido deseado que contiene tio-dT. Sin embargo, S-alquil 4 TioT es muy reactivo con los nucleófilos. Por lo tanto, los oligonucleótidos sintetizados con 4 tio T deben cortarse con NaSH en presencia de amonio. Tal como se ha indicado anteriormente, debe eliminarse por completo cualquier reactivo de desprotección remanente.

Sin embargo, tal como se mostrará en la sección de Ejemplos, un oligonucleótido con 4-tiotimidina (4-tioT) incorporado en el mismo no es muy estable frente a la hidrólisis bajo condiciones de desprotección estándares y en general puede encontrarse expuesto al ataque nucleofílico. A su vez lo anterior resultaría en Inestabilidad de un conjugado basado en la incorporación de dicho tionucleósido.

Tal como resultará evidente a partir de la descripción anteriormente proporcionada de la técnica anterior, existe una necesidad de un procedimiento económico y simple para la síntesis de un oligonucleótido que comprende un tionucleótido y/o para unir dicho oligonucleótido a un metal tiofílico, tal como el oro o un punto cuántico. Un requisito de simplicidad es, por ejemplo, que el grupo que permite la unión del oligonucleótido a una superficie pueda introducirse en el oligonucleótido directamente durante la síntesis química de un oligonucleótido sin ninguna necesidad de apartarse de los protocolos estándares establecidos de síntesis de oligonucleótidos.

Inesperadamente se ha encontrado que un oligonucleótido que comprende uno o más grupos tiol puede sintetizarse fácilmente mediante la incorporación de una tiooxonucleobase según la fórmula I en dicho oligonucleótido.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a un conjugado de oligonucleótido-fase sólida, en el que la fase sólida es tiofílica, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:

en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2, en la que -- Indica un enlace covalente, y en el que dicho oligonucleótido se une a dicha fase sólida mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido.

Se da a conocer además un método para producir un conjugado de oligonucleótido-fase sólida, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una fase sólida tiofílica seleccionada de entre el grupo que consiste de un metal tiofílico, un óxido inorgánico, sulfuro, selenluro o teluluro que comprende un metal tiofílico, por ejemplo tal como en los puntos cuánticos basados en Cd, y (b) unión de un oligonucleótido que contiene por lo menos una

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tiooxonucleobase según la fórmula I, tal como se ha proporcionado y definido anteriormente, a dicha fase sólida... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida, en el que la fase sólida comprende un metal tiofílico, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:

en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2, en la que Indica un enlace covalente, y en el que dicho oligonucleótldo se une a dicha fase sólida mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido.

2. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 1, en el que X en la fórmula I es CH.

3. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 1 ó 2, en el que la fase sólida tiofílica se

selecciona de entre el grupo que consiste de un metal noble tiofílico o un nanocristal semiconductor que comprende un metal tiofílico.

4. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fase sólida tiofílica es un metal noble seleccionado de entre el grupo que consiste de oro y plata.

5. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 4, en el que el metal es oro.

6. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la fase

sólida es una nanopartícula de oro.

7. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 4, en el que el metal es oro presente como una capa sobre un soporte sólido.

8. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 1, en el que la fase sólida tiofílica es un material semiconductor tiofílico.

9. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según la reivindicación 8, en el que el material semiconductor tiofílico se encuentra presente en forma de un nanocristal.

1. Conjugado de oligonucleótido-fase sólida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el oligonucleótido presenta una longitud de por lo menos 8 nucleótidos.

11. Método para producir un conjugado de oligonucleótido-fase sólida, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar una fase sólida que comprende un metal tiofílico y b) unir un oligonucleótido que contiene por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:

en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2 y en la que indica un enlace covalente, a dicho metal tiofílico mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido.

12. Método según la reivindicación 11, en el que en el oligonucleótido el tiooxonucleótido basado en un nucleósido de fórmula I es un 7-deazanucleótido, es decir, en el que X es CH.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que el oligonucleótido presenta una longitud de por lo menos 8 nucleótidos.

14. Utilización in vitro de un conjugado de oligonucleótido-fase sólida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 en un método de detección basado en la hibridación de ácidos nucleicos.

15. Utilización in vitro de un conjugado de oligonucleótido-nanopartícula según la reivindicación 6 ó 9 como

marcaje.