Composiciones y procedimientos de uso de mezclas estandarizadas.

Un procedimiento de valoración de la cantidad de un primer ácido nucleico en una primera muestra,

que comprende:

proporcionar una mezcla estandarizada que comprende un molde competitivo de dicho primer ácido nucleico y un molde competitivo de un segundo ácido nucleico en dicha primera muestra, en el que dichos moldes competitivos están a concentraciones conocidas uno respecto a otro;

combinar dicha primera muestra con dicha mezcla estandarizada;

coamplificar dicho primer ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico, produciendo un primer producto amplificado del mismo sin coamplificar dicho segundo ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico;

diluir dicho primer producto amplificado;

coamplificar además dicho primer producto amplificado diluido de dicho primer ácido nucleico y de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico, produciendo un segundo producto amplificado del mismo;

coamplificar dicho segundo ácido nucleico, en la que dicho segundo ácido nucleico sirve como primer ácido nucleico de referencia, y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico en dicho primer producto amplificado de dicho primer ácido nucleico, produciendo el primer producto amplificado del mismo;

y

obtener una primera relación comparando el segundo producto amplificado del ácido nucleico diana con el segundo producto amplificado del molde competitivo del ácido nucleico diana; y

obtener una segunda relación comparando el primer producto amplificado del ácido nucleico de referencia con el primer producto amplificado del molde competitivo del ácido nucleico de referencia; y

comparar la primera y segunda relaciones, determinando así la cantidad del primer ácido nucleico.

Composiciones y procedimientos de uso de mezclas estandarizadas Ciertas realizaciones de la presente invención se hicieron bajo las becas de investigación números ES02679 y ES01247 de los Institutos Nacionales de la Salud, la beca nº RR00044 de la División de Recursos de Investigación, el contrato 91-2 de los Institutos de la Salud y el contrato CH61 de la Organización Internacional del Plomo y Cinc, que pueden tener ciertos derechos sobre ellas. Ciertas realizaciones de la invención se hicieron bajo las becas de investigación nº NIH CA85147, CA 95806 y CA 103594, que pueden tener ciertos derechos sobre ellas. Ciertas realizaciones de la presente invención se hicieron bajo la beca de investigación número EO 1640 de los Institutos Nacionales de la Salud, que pueden tener ciertos derechos sobre ellas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Con la secuenciación del genoma humano, aparece la esperanza de acelerar el desarrollo de fármacos y descubrir mejores ensayos de diagnóstico. Esta esperanza ha creado la necesidad de desarrollar procedimientos mejorados para la medida de la expresión multigénica. Son particularmente necesarios procedimientos susceptibles de un control de calidad apropiado, por ejemplo, para satisfacer las directrices regulatorias. La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos dirigidos a abordar estas esperanzas y necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Es un primer aspecto descrito en la presente memoria un procedimiento que comprende proporcionar una primera muestra que comprende un primer ácido nucleico; amplificar dicho primer ácido nucleico y obtener una relación en la que dicha relación puede dar cuenta de menos de aproximadamente 1.000 moléculas de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra. Se describe además que dicha relación puede dar cuenta de menos de aproximadamente 100 moléculas, menos de aproximadamente 10 moléculas o menos de aproximadamente 1 molécula de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra. Se describe también en la presente memoria que dicha relación compara una primera relación de producto amplificado de dicho primer ácido nucleico a producto coamplificado de un molde competitivo de dicho primer ácido nucleico con una segunda relación de producto amplificado de un segundo ácido nucleico en dicha primera muestra a producto coamplificado de un molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico. Típicamente, dicho primer ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico se coamplifican en un primer recipiente y dicho segundo ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico se coamplifican en un segundo reciente. El molde competitivo del primer o segundo ácido nucleico puede comprender una secuencia referenciada en la Tabla 4. Se describe además que el segundo ácido nucleico sirve como primer ácido nucleico de referencia, por ejemplo, como control de carga. El primer ácido nucleico de referencia puede corresponder a al menos un gen seleccionado de GADP, ACTB y β-actina. La relación puede comparar además el producto amplificado de una serie de otro (s) ácido (s) nucleico (s) con el producto coamplificado de molde (s) competitivo (s) de dicha serie de otro (s) ácido (s) nucleico (s) . Al menos uno de dichos otros ácidos nucleicos puede servir como segundo ácido nucleico de referencia. El segundo ácido nucleico de referencia puede corresponder a al menos un gen seleccionado de GADP, ACTB y β-actina. Se describe además que la relación comprende el uso de electroforesis capilar de microfluidos, matriz de oligonucleótidos, espectrometría de masas o cromatografía. Se describe también en la presente memoria que la relación no implica tomar medidas a tiempo real ni la generación de una curva patrón. La relación puede controlar las fuentes de variación seleccionadas de carga de ADNc, eficacia de amplificación intraácido nucleico, eficacia de amplificación interácido nucleico, eficacia de amplificación interespécimen, eficacia de amplificación intermuestra y eficacia de amplificación intramuestra. La relación es capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 2 veces o una diferencia de menos de aproximadamente 1 vez. La relación es capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente un 80 %, una diferencia de menos de aproximadamente un 50 %, una diferencia de menos de aproximadamente un 30 % o una diferencia de menos de aproximadamente un 20 %. Se describe además en la presente memoria que la relación es capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 2 veces o una diferencia de menos de aproximadamente 1 vez en aproximadamente 100 moléculas o menos o en aproximadamente 10 moléculas o menos de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra. La diferencia detectada puede ser una diferencia de menos de aproximadamente un 80 %, una diferencia de menos de aproximadamente un 50 %, una diferencia de menos de aproximadamente un 30 % o una diferencia de menos de aproximadamente un 20 %. Se describe también en la presente memoria que la relación proporciona un coeficiente de variación de menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 % o menos de aproximadamente un 5 % entre dicha primera muestra y una segunda muestra de dicho primer ácido nucleico. Se describe además en la presente memoria que la primera y dicha segunda muestras se amplifican en momentos diferentes, la primera y dicha segunda muestras se amplifican en laboratorios diferentes o la primera y dicha segunda muestras se proporcionan de sujetos diferentes. El primer ácido nucleico puede comprender una secuencia referenciada en la Tabla 1 o 2. Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden reducir o eliminar los falsos negativos, preferiblemente los falsos positivos se reducen a un número estadísticamente no significativo. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARN o una molécula de ADN. Típicamente, la relación es sustancialmente constante más allá de la fase exponencial de dicha amplificación de dicho primer ácido nucleico.

Se describe también en la presente memoria un procedimiento de valoración de un primer ácido nucleico proporcionado en una primera muestra, que comprende coamplificar dicho primer ácido nucleico, una serie de otro (s) ácido (s) nucleico (s) , un molde competitivo de dicho primer ácido nucleico y molde (s) competitivo (s) de dicho (s) otro (s) ácido (s) nucleico (s) , en el que dichos moldes competitivos están a concentraciones conocidas uno respecto a otro, produciendo un primer producto amplificado de los mismos; diluir dicho primer producto amplificado y coamplificar además dicho primer producto amplificado diluido de dicho primer ácido nucleico y de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico, produciendo un segundo producto amplificado del mismo. Típicamente, el número es de al menos aproximadamente 1 otro ácido nucleico, al menos aproximadamente 100 otros ácidos nucleicos, o el número es de al menos aproximadamente 1.000 otros ácidos nucleicos. Típicamente, la dilución produce una dilución de al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 1.000 veces o al menos aproximadamente 10.000 veces. Preferiblemente, el procedimiento da cuenta de menos de aproximadamente 1.000 moléculas de dicho primer ácido nucleico en dicha muestra, de menos de aproximadamente 100 moléculas de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra, de menos de aproximadamente 10 moléculas de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra o de aproximadamente 1 molécula de dicho primer ácido nucleico en dicha primera muestra. Preferiblemente, al menos uno de dichos moldes competitivos comprende una secuencia referenciada en la Tabla 4. El primer ácido nucleico puede comprender una secuencia referenciada en la Tabla 1 o 2. Uno de los otros ácidos nucleicos puede servir como primer ácido nucleico de referencia, tal como control de carga. El primer ácido nucleico de referencia puede corresponder a al menos un gen seleccionado de GADP, ACTB y β-actina. Se describe además en la presente memoria que el procedimiento de valoración comprende obtener una primera relación, comparando dicha primera relación dicho segundo producto amplificado de dicho primer ácido nucleico con dicho segundo producto amplificado de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico; obtener una segunda relación, comparando dicha segunda relación dicho primer producto amplificado de dicho primer ácido nucleico de referencia con dicho primer producto amplificado de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico de referencia y comparar dichas primera y segunda relaciones. Se describe también en la presente memoria que... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de valoración de la cantidad de un primer ácido nucleico en una primera muestra, que comprende:

proporcionar una mezcla estandarizada que comprende un molde competitivo de dicho primer ácido nucleico y un molde competitivo de un segundo ácido nucleico en dicha primera muestra, en el que dichos moldes competitivos están a concentraciones conocidas uno respecto a otro;

combinar dicha primera muestra con dicha mezcla estandarizada;

coamplificar dicho primer ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico, produciendo un primer producto amplificado del mismo sin coamplificar dicho segundo ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico;

diluir dicho primer producto amplificado;

coamplificar además dicho primer producto amplificado diluido de dicho primer ácido nucleico y de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico, produciendo un segundo producto amplificado del mismo;

coamplificar dicho segundo ácido nucleico, en la que dicho segundo ácido nucleico sirve como primer ácido nucleico de referencia, y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico en dicho primer producto amplificado de dicho primer ácido nucleico, produciendo el primer producto amplificado del mismo;

y

obtener una primera relación comparando el segundo producto amplificado del ácido nucleico diana con el segundo producto amplificado del molde competitivo del ácido nucleico diana; y

obtener una segunda relación comparando el primer producto amplificado del ácido nucleico de referencia con el primer producto amplificado del molde competitivo del ácido nucleico de referencia; y

comparar la primera y segunda relaciones, determinando así la cantidad del primer ácido nucleico.

2. El procedimiento como se indica en la reivindicación 1, que comprende además:

diluir dicho producto amplificado de dicho primer ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico; y coamplificar además dicho producto amplificado diluido, produciendo un producto amplificado adicional del mismo.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además:

diluir dicho producto amplificado de dicho segundo ácido nucleico y dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico, y coamplificar además dicho producto amplificado diluido, produciendo un producto amplificado adicional del mismo.

4. El procedimiento como se indica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho primer ácido nucleico de referencia es un control para la carga de ADNc en la reacción.

5. El procedimiento como se indica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho primer ácido nucleico de referencia corresponde a al menos un gen seleccionado de GADH, ACTB y β-actina.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer ácido nucleico comprende una secuencia correspondiente a un gen referenciado en la Fig. 1 o 2.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho molde competitivo de dicho primer o dicho segundo ácido nucleico comprende una secuencia referenciada en las Fig.

4. 4B.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico está a una serie de concentraciones respecto a dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico.

9. El procedimiento como se indica en la reivindicación 8, en el que dicha serie de concentraciones proporciona diluciones en serie de 10 veces de dicho molde competitivo de dicho primer ácido nucleico respecto a dicho molde competitivo de dicho segundo ácido nucleico.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que obtener dicha primera o dicha segunda relaciones comprende el uso de electroforesis capilar de microfluidos, matriz de oligonucleótidos,

espectrometría de masas o cromatografía.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dichas mezclas estandarizadas controlan al menos dos fuentes de variación seleccionadas de carga de ADNc, eficacia de amplificación intraácido nucleico, eficacia de amplificación interácido nucleico, eficacia de amplificación interespécimen, eficacia de amplificación intermuestra y eficacia de amplificación intramuestra.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho procedimiento está informatizado y en el que dicha informatización comprende instruir a un manipulador robótico para seleccionar dicha primera de las mezclas estandarizadas diluidas en serie para combinación.

13. El procedimiento como se indica en la reivindicación 12, en el que dicha informatización comprende obtener dicha primera relación.

14. El procedimiento como se indica en la reivindicación 13, en el que obtener dicha primera relación implica determinar un área bajo la curva.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha informatización comprende instruir a un manipulador robótico para seleccionar dicha segunda de las mezclas estandarizadas diluidas en serie basándose en dicha primera relación.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho ácido nucleico comprende una molécula de ARN.

17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho ácido nucleico comprende una molécula de ADN.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de proporcionar la mezcla estandarizada comprende: preparar una mezcla estandarizada de reactivos, comprendiendo dichos reactivos suficiente molde competitivo para valorar las cantidades de una serie de ácidos nucleicos en más de aproximadamente 106 muestras, en el que dicha mezcla estandarizada permite la comparación directa de dichas cantidades entre dos de dichas muestras.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que dichos reactivos comprenden además un cebador directo y/o un cebador inverso para cebar la amplificación de dicho molde competitivo de dicho número de ácido (s) nucleico (s) .

Los valores de expresión génica (media) se reseñan como moléculas por 10677 moléculas de actina 2SD= desviación estándar

3ND= no detectable 4 Se determinaron los valores mediante la prueba t de Student entre células H460 y H1435, números en negrita= significativos, p< 0, 05

NE= no evaluado Figura 1

Figura 3

Expresión génica media en ADNc de referencia universal medida mediante los procedimientos dados a conocer en la presente memoria Figura 4a Expresión génica media en ADNc de referencia universal medida mediante los procedimientos dados a conocer en la presente memoria Figura 4B

Figura 5 Figura 6

Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Fuentes de variación en la medida de expresión génica por RT-PCR cuantitativa y procedimientos de control

Fuente de variación Realizaciones de Tiempo real

procedimientos descritos en la presente memoria

Carga de ADNc: Debido a la variación en el Amplificación múltiple con gen de Amplificación múltiple con

pipeteado, cuantificación o transcripción inversa. referencia (por ejemplo, β-actina) gen de referencia (por ejemplo, β-actina)

Consecuencia: comparación poco fiable de la

expresión del mismo gen en dos muestras

diferentes

Variación de ciclo a ciclo de la eficacia de CT de patrón interno para cada Medida a tiempo real

amplificación intraácido nucleico: fases de gen en una mezcla estandarizada

meseta temprana lenta, logarítmica lineal y de patrones internos (SMIS)

tardía lenta

Consecuencia: comparación poco fiable de la

expresión del mismo gen en diferentes

muestras

Eficacia de la amplificación interácido nucleico: CT de patrón interno para cada Curva patrón externa para

en la eficacia de los cebadores gen en una SMIS cada gen medido

Consecuencia: comparación poco fiable de la

expresión de diferentes genes en la misma o

diferentes muestras

Eficacia de amplificación interespécimen: CT de patrón interno para cada Curva patrón de la muestra

presencia variable de un inhibidor de PCR gen en una SMIS de referencia en

Consecuencia: comparación poco fiable de la expresión del mismo o diferentes genes en la comparación con la muestra de ensayo2

misma o diferentes muestras

Eficacia de amplificación intermuestra: en la CT de patrón interno para cada Ninguno2

calidad y/o concentración de reactivos de PCR gen en una SMIS

(por ejemplo, cebadores) en presencia de un

inhibidor de PCR

Consecuencia: comparación poco fiable de la

expresión del mismo o diferentes genes en la

misma o diferentes muestras

Eficacia de amplificación intramuestra: en la CT de patrón interno para cada Ninguno2

eficacia del termociclador gen

Consecuencia: por ejemplo, comparación poco

fiable de la expresión del mismo o diferentes

genes en la misma o diferentes muestras

Figura 22

Dilución máxima a la que podían detectarse los productos de PCR cuantificables. Para reacciones individuales (ciclos de ronda 2= 0) , la dilución mostrada es la de la mezcla de partida de ADNc y mezcla de CT. Para las reacciones múltiples, las diluciones mostradas son las de productos de ronda 1 (por ejemplo 1/100= 1 ml de los 10 ml del producto de ronda 1 + 9 ml de agua)

Los valores de expresión génica se reseñan como moléculas por 106 moléculas de β-actina 3 NA= no aplicable Figura 29 Figura 30 Figura 31 Figura 32 Figura 33 Figura 34 Figura 35 Figura 36A Figura 36B

Datos densitométricos del primer carril de muestra de la Fig. 34

Longitud (pares Valores Corrección de Valores

de bases) densitoméricos tamaño densitométricos

Zeineh relativos

(A) GAPDH

GAPDH nativo y heterodímero (N2+2NM) 788 10.095 0, 820

GAPDH mutado (M2) 588 1.652 X788/588= 0, 180

2214

(B) GSH-Px

GSH-Px mutado heterodímero (N2+2M) y 354 6.709 0, 442

GSH-Px (N2) 280 6.662 X354/280= 0, 558

8461

GEN Datos de expresión usando algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria Datos de micromatriz expresión de

SVpgC2a HOE Diferencia en veces: SVpgC2a/HOE Diferencia en SVpgC2a/HOE veces:

AHR 420 125 3, 3 +3, 2

GSTM1, 2, 4, 5 260 30 8, 6 +9

GSTP1 10200 26.000 -2, 5 -1, 8

SOD2 2300 420 5, 5 5, 1

GPX1 17500 27.000 -1, 5 -2, 4

La comparación de los datos de expresión génica por micromatriz (técnica de chip de ADNc) en células epiteliales orales humanas normales o inmortalizadas confirmó el concepto de que las matrices génicas son procedimientos de cribado valiosos mientras que otras técnicas, como los procedimientos descritos en la presente memoria, permiten un análisis de expresión génica más detallado Figura 37