Composiciones y métodos para la detección de ciertos flavivirus, incluidos los miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa.

Un equipo para la detección de un ácido nucleico de varios miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa en una muestra biológica en condiciones de hibridación restrictivas,

que comprende:

a) un primer oligonucleótido cebador que comprende el Id. de Sec. Nº: 8 o un complementario del mismo;

b) un segundo oligonucleótido cebador que comprende el Id. de Sec. Nº: 15 o un complementario del mismo; y

c) un tercer oligonucleótido sonda marcado de forma detectable que comprende el Id. de Sec. Nº: 28, o el complementario del mismo, en el que el marcador detectable en el tercer oligonucleótido sonda es una porción fluorescente.

Composiciones y métodos para la detección de ciertos flavivirus, incluidos los miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa

Antecedentes de la invención

La familia Flaviviridae y el género Flavivirus abarca un número de virus que son patógenos humanos potencialmente letales. Tales virus incluyen el virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, el virus de Modoc y los virus del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. El serogrupo del virus de la encefalitis japonesa incluye varios virus estrechamente relacionados, como el virus de la encefalitis japonesa (VEJ), el virus del Nilo Occidental (VNO), virus de la encefalitis de San Luis, el virus de la encefalitis del Valle de Murray y el virus de Kunjin. El virus de Kunjin se refiere a menudo como una variante del VNO por el grado de conservación de secuencia entre estos dos virus. Las cepas caracterizadas del VNO se han dividido en dos grupos, linaje I y linaje II, basado en el análisis de secuencias.

En 1999, se reportó el primer caso de infección por el VNO humano en los EE.UU. Desde entonces, se han producido epidemias anuales. En agosto de 22, se confirmó la transmisión del virus del Nilo Occidental a través de vías diferentes a las picaduras de mosquitos cuando cuatro receptores de órganos se infectaron por un solo donante de órganos. El virus, desde entonces, se ha encontrado que es transmisible por transfusión de productos sanguíneos (21 casos confirmados) y por la leche materna.

La detección de la infección por el VNO activo es difícil, ya que los síntomas no son específicos y los anticuerpos específicos del virus por lo general se pueden detectar sólo después de la fase de viremia. Por otra parte, la IgM específica del VNO puede persistir durante más de un año, por lo que es difícil diferenciar entre infección activa y exposición en el pasado. Los métodos de detección más sensibles, como la detección directa de ácidos nucleicos virales, son necesarios. La detección de ácidos nucleicos virales presenta un método más sensible para la detección temprana de la infección por VNO y otros flavivirus que los métodos serológicos actualmente en uso.

Otros flavivirus, entre ellos miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa, son también patógenos humanos. Estos patógenos incluyen miembros del serogrupo de la encefalitis japonesa, tales como el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Louis (VESL), y el virus de la encefalitis del valle de Murray, y otros flavivirus como el virus del dengue, virus de la fiebre amarilla y el virus de Modoc. La transmisión de los miembros del serogrupo de virus de la encefalitis japonesa distinta al VNO a través de productos sanguíneos permanece indocumentado. Sin embargo, dichas transmisiones son posibles, y cada vez más probable que ocurra, ya que estos virus están más diseminados. Por lo tanto, son altamente deseables nuevos ensayos específicos y sensibles que sean capaces de detectar estos flavivirus que son patógenos humanos. Además, un solo ensayo que sea capaz de detectar varios miembros del serogrupo de la encefalitis japonesa también sería muy deseable.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona equipos para detectar la presencia de un ácido nucleico de ciertos flavivirus, incluyendo varios miembros del serogrupo de virus de la encefalitis japonesa. Los equipos de la presente invención se basan, en parte, en el descubrimiento de oligonucleótidos que pueden ser utilizados por ejemplo, como cebadores y sondas para detectar la presencia de miembros del serogrupo de virus de la encefalitis japonesa. Por ejemplo, el virus del Nilo occidental, el virus Kunjin, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Louis (VESL) y el virus de la encefalitis del valle de Murray se pueden detectar con los oligonucleótidos de la invención. Además, los oligonucleótidos descritos se pueden utilizar para detectar flavivirus fuera del serogrupo de virus de la encefalitis japonesa, incluyendo, por ejemplo, el virus de Dengue, el virus de la leucoencefalitis del Myotis de Montana, el virus Modoc, y el virus de la fiebre amarilla. Los oligonucleótidos descritos en este documento pueden ser utilizados como cebadores y sondas para detectar estos flavivirus de acuerdo con los métodos descritos en este documento.

La invención se refiere a un equipo para la detección de un ácido nucleico de varios miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa en una muestra biológica en condiciones de hibridación restrictivas, que comprende:

a) un primer oligonucleótido cebador que comprende el Id. de Sec. N°: 8 o un complementario del mismo;

b) un segundo oligonucleótido cebador que comprende el Id. de Sec. N°: 15 o un complementario del mismo; y

c) un tercer oligonucleótido de sonda marcado de forma detectable que comprende el Id. de Sec. N°: 28, o el complementario del mismo,

en el que el marcador detectable en el tercer oligonucleótido de sonda es una porción fluorescente.

De acuerdo con la invención, la porción detectable en el tercer oligonucleótido sonda es una porción fluorescente. En ciertas realizaciones, la porción fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste de colorantes de la familia de la fluoresceína, colorantes de la familia de la polihalofluoresceína, colorantes de la familia de la hexaclorofluoresceína, colorantes de la familia de la cumarina, colorantes de la familia de la rodamina, colorantes de

la familia de la cianina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia de la escuarina, colorantes de la familia de los lantánidos quelados y colorantes de la familia de la BODIPY®. En una realización preferida, la porción fluorescente es 6-carboxifluoresceína.

En ciertas realizaciones, el ollgonucleótldo sonda marcado de forma detectable comprende una porción atenuadora. La porción atenuadora puede ser cualquier porción atenuadora conocida para un experto en la materia sin limitación. En ciertas realizaciones, la porción atenuadora se puede seleccionar del grupo que consiste de colorantes de la familia de la fluoresceína, colorantes de la familia de la polihalofluoresceína, colorantes de la familia de la hexaclorofluoresceína, colorantes de la familia de la cumarina, colorantes de la familia de la rodamina, colorantes de la familia de la cianina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia de la escuarina, colorantes de la familia de los lantánidos quelados y colorantes de la familia de la BODIPY®, y porciones atenuadoras no fluorescentes. En ciertas realizaciones, las porciones atenuadoras no fluorescentes pueden ser colorantes de la familia de los BHQ , lowa Negro , o Dabcyl. En una realización preferida, la porción atenuadora es Cy5 .

También se describe un método para detectar un ácido nucleico de vahos miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. En el método, un oligonucleótido de la invención marcado de forma detectable, que se describe en detalle más adelante, se utiliza como una sonda para detectar un ácido nucleico de varios miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. La sonda se hibrida con un ácido nucleico de Id. de Sec. N°: 16 o el complementario del mismo, que es una secuencia de una región conservada en la región no traducida 3' de los ácidos nucleicos de flavivirus que se pueden detectar según la presente invención. En ciertas realizaciones de la invención, una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde con actividad exonucleasa 5-3, fragmenta la sonda, en las que la fragmentación de la sonda marcada de forma detectable indica la presencia del ácido nucleico de un miembro del serogrupo de la encefalitis japonesa.

También se describen los métodos que comprenden amplificar el ácido nucleico de un miembro del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa en presencia de una sonda de ácido nucleico marcada de forma detectable, en el que la sonda de ácido nucleico marcada de forma detectable comprende al menos 2 nucleótidos consecutivos de Id. de Sec. N°: 17, o el complementario del mismo. En ciertos aspectos, los métodos comprenden amplificar el ácido nucleico de un miembro del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa en presencia de un oligonucleótido marcado de forma detectable, en el que el oligonucleótido marcado de forma detectable comprende el Id. de Sec. N°: 18, o el complementario del mismo. El Id. de Sec. N°: 18 es una secuencia de oligonucleótido que se hibrida con una reglón conservada de los ácidos nucleicos de flavivirus actualmente conocidos que se pueden detectar según la... [Seguir leyendo]

1. Un equipo para la detección de un ácido nucleico de varios miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa en una muestra biológica en condiciones de hibridación restrictivas, que comprende:

a) un primer oligonucleótldo cebador que comprende el Id. de Sec. N°: 8 o un complementario del mismo;

b) un segundo oligonucleótldo cebador que comprende el Id. de Sec. N°: 15 o un complementario del mismo; y

c) un tercer oligonucleótldo sonda marcado de forma detectable que comprende el Id. de Sec. N°: 28, o el complementarlo del mismo, en el que el marcador detectable en el tercer oligonucleótido sonda es una porción fluorescente.

2. El equipo de la reivindicación 1, en el que el residuo en la posición 24 del Id. de Sec. N°: 8 es Ne-alquil- desoxiadenosina.

3. El equipo de la reivindicación 1, en el que el tercer oligonucleótido sonda marcado de forma detectable comprende además una porción atenuadora.

4. El equipo de la reivindicación 1, en el que la porción fluorescente se selecciona del grupo que consiste en colorantes de la familia de la fluoresceína, colorantes de la familia de la polihalofluoresceína, colorantes de la familia de la hexaclorofluoresceína, colorantes de la familia de la cumarina, colorantes de la familia de la rodamina, colorantes de la familia de la cianina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia de la escuarina, colorantes de la familia de los lantánidos quelados y colorantes de la familia de BODIPY®.

5. El equipo de la reivindicación 1, en el que la porción fluorescente es 6-carboxifluoresceína.

6. El equipo de la reivindicación 3, en el que la porción atenuadora se selecciona del grupo que consiste en colorantes de la familia de la fluoresceína, colorantes de la familia de la polihalofluoresceína, colorantes de la familia de la hexaclorofluoresceína, colorantes de la familia de la cumarina, colorantes de la familia de la rodamina, colorantes de la familia de la cianina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia de la escuarina, colorantes de la familia de los lantánidos quelados y colorantes de la familia de BODIPY®-famllla, y porciones atenuadoras no fluorescentes.

7. El equipo de la reivindicación 6, en el que la porción atenuadora no fluorescente es un colorante de la familia BHQ , lowa Black, o Dabcyl.

8. El equipo de la reivindicación 3, en el que la porción atenuadora es Cy5.

9. El equipo de la reivindicación 1, que comprende adlcionalmente una polimerasa de DNA termoestable.

1. El equipo de la reivindicación 9, en el que la polimerasa de DNA termoestable se selecciona entre el grupo de polimerasa de DNA de Carboxydothermus hydrogenformans, polimerasa de DNA de Thermosipho africanus, polimerasa de DNA de Bacillus pallidus, polimerasa de DNA de especies de Thermus Z5, polimerasa de DNA de Thermus aquatlcus, polimerasa de DNA de Thermus thermophilus, polimerasa de DNA de Thermatoga marítima, polimerasa de DNA de Thermatoga neapolltana, y polimerasa de DNA de Thermus sps17.

11. El equipo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente instrucciones para detectar un ácido nucleico de un miembro del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa.