Composiciones y métodos que comprenden el antigeno KLK3, PSCA o FOLH1.

Una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico,

comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.

Composiciones y métodos que comprenden el antígeno KLK3, PSCA o FOLH1.

CAMPO DELA INVENCIÓN

La presente invención proporciona péptidos KLK3 recombinantes, moléculas nucleotídicas recombinantes que codifican los mismos, cepas recombinantes de Listeria que comprenden los mismos, y usos inmunogénicos y terapéuticos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La estimulación de una respuesta inmune depende de la presencia de antígenos reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. Los antígenos bacterianos, tales como Salmonella enterica y Mycobacterium bovis BCG, permanecen en el fagosoma y estimulan los linfocitos T CD4+ mediante la presentación antigénica a través de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II.En contraste, los antígenos bacterianos, tales como Listeria monocytogenes, salen del fagosoma hacia el citoplasma. El escape fagolisosomal de L. monocytogenes es un mecanismo único que facilita una presentación antigénica del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de antígenos listerianos. Este escape depende de la citolisina activada por sulfhidrilo formadora de poros, listeriolisina O (LLO) .

ActA es una proteína listeriana asociada a la superficie, y actúa como una estructura en las células huésped infectadas para facilitar la polimerización, el montaje y la activación de polímeros de actina huésped para propulsar el organismo de Listeria a través del citoplasma. Poco después de la entrada en el citosol de la célula mamífera, L. monocytogenes induce la polimerización de los filamentos de actina huésped y usa la fuerza generada por la polimerización de la actina para desplazarse, primero intracelularmente y después de célula a célula. Una única proteína bacteriana, ActA, es responsable de mediar la nucleación de la actina y la movilidad basada en actina. La proteína ActA proporciona múltiples sitios de unión para los componentes citoesqueléticos huésped, actuando de este modo como una estructura para montarla maquinaría de polimerización de la actina celular.ElextremoNH2de ActA se une a la actina monomérica y actúa como un factor promotor de la nucleación constitutivamente activa estimulando la actividad de nucleación de la actina intrínseca. Tanto ActA como hly son miembros del grupo génico de 10 kb regulado por el activador transcripcional PrfA, y se regula al alza aproximadamente 226 veces en el citosol mamífero.

El cáncer de próstata es el tipo más frecuente de cáncer en los hombres Americanos y es la segunda causa más importante de muerte relacionada con cáncer en esta población. El antígeno prostático específico (PSA, Prostate Specific Antigen) es un marcador para el cáncer de próstata que se expresa altamente por los tumores prostáticos. Existe la necesidad desde hace tiempo de desarrollar composiciones y métodos para potenciar la inmunogenicidad de los antígenos, especialmente antígenos útiles en la prevención y el tratamiento de tumores y patógenos intracelulares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal mejora la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal. En una realización, la cepa recombinante de Listeria se pasa a través de un huésped animal.

La cepa recombinante de Listeria puede ser una cepa auxótrofa de Listeria o una cepa recombinante de Listeria monocytogenes. La cepa auxótrofa de Listeria puede ser un mutante dal/dat o puede comprender adicionalmente una deleción en el gen endógeno ActA. La cepa auxótrofa de Listeria puede comprender un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofía de la cepa auxótrofa de Listeria, y la enzima metabólica puede ser una enzima alanina racemasa o una enzima D-aminoácido transferasa.

La presente invención también proporciona un polipéptido recombinante que comprende un péptido de fusión de un péptido KLK3 que está unido de forma operativa a un péptido LLO N-terminal, en el que dicho polipéptido recombinante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en el que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en el que el péptido KLK3 no contiene unasecuencia de señal.Lainvención también proporciona unamoléculanucleotídica quecodifica el polipéptido recombinante, y un vector de vacuna recombinante que codifica el polipéptido recombinante o que comprende la molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende la cepa recombinante de Listeria, el polipéptido recombinante o la molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante, yun adyuvante.

La invención proporciona la cepa recombinante de Listeria, o una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante, o el nucleótido recombinante, para su uso como un medicamento.

La invención proporciona adicionalmente la cepa recombinante de Listeria, o una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante o el nucleótido recombinante, para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

La invención también proporciona la cepa recombinante de Listeria, el polipéptido recombinante, o el nucleótido recombinante, para su uso en el tratamiento, inhibición o supresión de un cáncer de próstata que expresa la proteína peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frente al cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3.

El polipéptido recombinante puede hacerse mediante un proceso que comprende la etapa de conjugar químicamente un polipéptido que comprende el péptido KLK3 con un polipéptido que comprende el péptido LLO Nterminal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Lm-E7 y Lm-LLO-E7 usan diferentes sistemas de expresión para expresar y secretar E7. Lm-E7 se generó introduciendo un cassette de gen en el dominio orfZ del genoma de L. monocytogenes (A) . El promotor hly impulsa la expresión de la secuencia de señal hly y los primeros cinco aminoácidos (AA) de LLO seguido de HPV-16 E7. B) , Lm-LLO-E7 se generó transformando la cepa prfA-XFL-7 con el plásmido pGG-55. pGG-55 tiene el promotor hly que impulsa la expresión de una fusión no hemolítica de LLO-E7. pGG-55 también contiene el gen prfA para seleccionar la retención del plásmido por XFL-7 in vivo. Figura 2. Lm-E7 y Lm-LLO-E7 secretan E7. Lm-Gag (carril 1) , Lm-E7 (carril 2) , Lm-LLO-NP (carril 3) , LmLLO-E7 (carril 4) , XFL-7 (carril 5) y10403S (carril 6) se dejaron crecerduranteuna noche a 37 º C en caldo Luria-Bertoni. Se granularon números equivalentes de bacterias, como se determinó por DO a 600 nm de absorbancia, y 18 ml de cada sobrenadante se precipitaron con TCA. La expresión de E7 se analizó por transferencia deWestern.La transferencia sesondeó con un mAb anti-E7 seguido de anti-ratón conjugado con HRP (Amersham) , y despuésse desarrolló usando reactivos de detección ECL. Figura 3. A. Eficacia inmunoterapéutica tumoral de fusiones LLO-E7. El tamaño del tumor en milímetros en ratones se muestra en 7, 14, 21, 28 y 56 días después de la inoculación del tumor. Ratones sin tratar: triángulos blancos; Lm-LLO-E7: círculos negros; Lm-E7: rombos negros; Lm-Gag: X; y Lm-LLO-NP: símbolo +. B. Eficacia inmunoterapéutica tumoral de fusiones LLO-Ova. Figura 4. Los esplenocitos de ratones inmunizados con Lm-LLO-E7 proliferan cuando se exponen a células TC-1. Los ratones C57BL/6se inmunizaron yse reforzaron con cepas Lm-LLO-E7, Lm-E7 o rLm de control. Los esplenocitos se recuperaron 6 días después del refuerzo y se pusieron en placas con células TC-1 irradiadas en las proporcionadasmostradas. Las célulasse pulsaron con 3H timidina y se recuperaron. Cpm se define como (cpm experimental) - (control no TC-1) . Figura 5. Eficacia inmunoterapéutica tumoral del antígeno NP expresada en LM. El tamaño del tumor en milímetros en ratones se muestra en 10, 17, 24 y 38 días después de la inoculación del tumor. Ratones sin tratar: X; ratones a los que se les administró Lm-LLO-NP: rombos negros; Lm-NP: cuadrados; Lm-Gag: círculos negros. Figura 6. Representación de constructos de virus vaccinia que expresan... [Seguir leyendo]

1. Una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.

2. La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 1, en la que la cepa recombinante de Listeria es una cepa auxótrofa de Listeria o una cepa recombinante de Listeria monocytogenes.

3. La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 2, en la que la cepa auxótrofa de Listeria es un mutante dal/dat o comprende adicionalmente una deleción en el gen endógeno ActA.

4. La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 2, en la que la cepa auxótrofa de Listeria comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofía de la cepa auxótrofa de Listeria.

5. La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 4, en la que la enzima metabólica es una enzima alanina racemasa o una enzima D-aminoácido transferasa.

6. La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 1, en la que la cepa recombinante de Listeria se ha pasado a través de un huésped animal.

7. Un polipéptido recombinante que comprende un péptido de fusión de un péptido KLK3 que está unido de forma operativa a un péptido LLO N-terminal, en el que dicho polipéptido recombinante comprende la secuencia de SEQID NO:54 o una secuenciahomóloga al menos al 99% a la misma, en el que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en el que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.

8. Una molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante de la reivindicación 7.

9. Una vacuna que comprende la cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7 o la molécula nucleotídica de la reivindicación 8, y un adyuvante.

10. Una vector de vacuna recombinante que codifica el polipéptido recombinante de la reivindicación 7 o que comprende la molécula nucleotídica de la reivindicación 8.

11. La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

12. La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de un cáncer de próstata que expresa la proteína peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frente al cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3.

13. La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en la inhibición o la supresión de un cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3 en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frentealcáncerde próstata queexpresa la proteínaKLK3, inhibiendo osuprimiendode estemodo el cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3 en un sujeto.

14. El polipéptido recombinante de la reivindicación 7 hecho mediante un proceso que comprende la etapa de conjugar químicamente un polipéptido que comprende el péptido KLK3 en un polipéptido que comprende el péptido LLO N-terminal.

15. La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso como un medicamento.