Composiciones y métodos de reparación de lesiones vasculares.

Una composición farmacéutica estéril para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular causada por un infarto de miocardio en un sujeto,

estando la composición farmacéutica preparada mediante un proceso que comprende:

(a) purificación estéril de una población de células nucleadas comprendiendo células CD34+ obtenidas del sujeto bajo condiciones estériles para producir células CD34+ enriquecidas, en donde las células CD34+ enriquecidas , las cuales además contienen una subpoblación de células potentes CD34+/CXCR-4 que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4, son un producto de células madre hematopoyéticas quimio tácticas

(b) confirmación de que, durante por lo menos 24 horas después de la obtención de dicha población des células nucleadas comprendiendo células CD34+ del sujeto, la subpoblación de células potentes CD34+/CXCR-4, cuando analizadas in vitro después del paso a través de una catéter de por lo menos 0,36 mm de diámetro:

(i) tiene una actividad quimio táctica mediada por CXCR-4;

(ii) puede formar colonias hematopoyéticas; y

(iii) es, por lo menos, un 70% viable;

Comprendiendo la composición farmacéutica:

(1) una cantidad terapéutica del autologus aislado estéril producto de células madre hematopoyéticas quimio tácticas obtenido del sujeto y comprendiendo la aislada subpoblacion de células nucleadas 25 enriquecidas para células CD34+, las cuales además contienen una subpoblacion de células CD34+/CXCR-4+ que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4, en donde la cantidad terapéutica del producto de células madre hematopoyéticas quimio tácticas comprende por lo menos 0,5 x 106 células potentes CD34+/CXCR-4+ que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4y es efectiva para tratar la lesión vascular; y

(2) una cantidad estabilizante de suero, en donde la cantidad estabilizante de suero es de por lo menos el 10% (v/v) y es efectiva para retener la actividad quimio táctica mediada por CXCR-4 y la actividad de formar colonias hematopoyéticas de la subpoblación de células CD34+/CXCR-4+; en donde la composición farmacéutica es formulada para la administración al sujeto parenteralmente a través de un catéter.

Composiciones y métodos de reparación de lesiones vasculares.

Esta solicitud reivindica el beneficio del documento de patente United States Provisional Application Serial nº 5 60/734.151, presentada el 7de Noviembre de 2005.

AMBITO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las composiciones que comprenden un producto de células madre 10 hematopoyéticas quimio tácticas y a los métodos de utilización de las mismas en la reparación del daño causado por insuficiencia vascular, incluyendo miocardio infartado, así como otras condiciones vasculares similares o relacionadas con la insuficiencia vascular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 15

El infarto agudo de miocardio sigue siendo común con una incidencia anual registrada de 1, 1 millones de casos solamente en los Estados Unidos (Antman, E.M., Braunwald, E., Infarto agudo de miocardio, en Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Braunwald, E. et al., Eds., New York: McGraw-Hill (2001) ) . Datos preclínicos y clínicos demuestran que a continuación de un infarto de miocardio, la pérdida aguda de las células del músculo del 20 miocardio y al acompañante hipo-perfusión de la zona periférica del infarto dan como resultado una cascada de eventos que causa una disminución inmediata de la función cardiaca, con un potencial de persistencia a largo plazo. El grado de pérdida de células del miocardio depende de la duración de la oclusión de la arteria coronaria, de la circulación colateral coronaria existente y la condición de la micro vascularización cardíaca. Paul et al., Am Heart J. 131: 710-15 (1996) ; Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation 81:1161-72 (1990) ; Sheiban, I. e. al, J. Am. Coll. 25 Cardiol. 38: 464-71 (2001) ; Braunwald E., Bristow, M. R, Circulation n 102: IV-14-23 (2000) ; Rich et al., Am. J. Med 92:7-13 (1992) ; Ren et al., J. Hystochem. Cytochem. 49: 71-79 (2002) ; Hirai, T. et al., Circulation 79:791-96 (1989) ; Ejiri, M. et al., J. Cardiology 20: 31-37 (1990) . Debido a que las células del miocardio no tienen prácticamente ninguna capacidad de regenerarse, el infarto de miocardio conduce a una disfunción cardiaca permanente debida a la pérdida de células musculares contráctiles y su sustitución con una cicatriz fibrótica no funcional. Frangogiannis, 30 N.G., et al., Cardiovascular Res. 53: 31-47 (2002) . Además, la hipertrofia compensatoria del músculo cardiaco viable conduce a la insuficiencia micro vascular que da como resultado adicional la muerte de la función cardiaca causando la hibernación del musculo miocardial y la apoptosis de miocitos hipertrofiados en la zona periférica del infarto.

Entre los supervivientes de infarto de miocardio, la función cardiaca residual está influida en su mayor parte por el 35 grado de remodelación ventricular (cambios significativos en tamaño, forma y función, típicamente un declive en la función, del corazón después de la lesión) . Las alteraciones en la topografía ventricular (es decir, la forma, configuración o morfología de un ventrículo) ocurren en ambos el tejido infartado y el tejido cardíaco sano después del infarto de miocardio. Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation 81: 1161-72 (1990) . La dilatación ventricular (lo que significa un estiramiento, agrandado o extendido fuera de un ventrículo) provoca una disminución de la función 40 cardiaca global y se ve más afectada principalmente por el tamaño del infarto, curación del infarto y por las tensiones (stresses) de la pared ventricular. Los recientes esfuerzos para minimizar la remodelación han tenido éxito debido a la limitación del tamaño del infarto a través de una rápida reperfusión (lo que significa restauración del flujo de sangre) usando agentes tromobolíticos y las intervenciones mecánicas, incluyendo, pero no limitándose a, la colocación de un stent, junto con la reducción de las tensiones (stresses) en la pared ventricular mediante el uso 45 juicioso de terapias de precarga y la apropiada gestión de la post carga. Con independencia de estas intervenciones, un porcentaje importante de pacientes experimentan clínicamente relevantes disfunciones cardiacas a largo plazo después del infarto de miocardio. Sheiban, I. et al, J. Am Coll. Cardiol. 38: 464-71 (2001) . A pesar de la revascularización de la circulación de las arterias relacionadas con el infarto y la gestión médica apropiada para minimizar las tensiones (stresses) en la pared ventricular, un porcentaje significativo de pacientes experimentan un 50 remodelado ventricular, una disfunción cardiaca permanente y por lo tanto permanecen en un riesgo aumentado durante toda su vida de experimentar eventos cardíacos adversos incluyendo la muerte. Paul et al., Am. Heart J. 131:710-15 (1996) ; Pfeffer, M.A., Braunwald, E., Circulation 81:1161-72 (1990) .

Al nivel celular, inmediatamente después de un infarto al miocardio, ocurre una transitoria disfunción cardiaca 55 uniformemente generalizada. En el marco de una breve oclusión de la arteria coronaria (es decir, de una duración de tres minutos a cinco minutos) , se deteriora el metabolismo de la energía, lo que conduce a la disfunción del músculo cardiaco demostrable que puede persistir durante hasta las 48 horas a pesar de la reperfusión inmediata. Este denominado "fenómeno de miocardio aturdido" ocurre subsecuentemente a o después de la reperfusión y se piensa que es un resultado de especies de oxígeno reactivas. El proceso es transitorio y no está asociado con una 60 respuesta inflamatoria. Frangogiannis, N.G., et al., Cardiovascular Res. 53: 31-47 (2002) . Después de la revascularización con éxito, sucede, una recuperación significativa del aturdimiento, dentro de los tres o cuatro días aunque la recuperación completa puede tomar mucho más tiempo. Boli, R., Prog. Cardiovascular Disease 40 (6) : 477-515 (1998) ; Sakata, K. et al., Ann. Nucleic. Med. 8:153-57 (1994) ; Wollert, K.C. et al., Lancet 364: 141-48 (2004) . 65

La oclusión de la arteria coronaria de duración más significativa, es decir, que dura más de cinco minutos, conduce a una isquemia miocardial (es decir, un flujo de sangre insuficiente a la masa muscular del corazón) y está asociada con una respuesta inflamatoria significativa que comienza inmediatamente después de la reperfusión y puede durar hasta varias semanas. Frangogiannis, N.G., et al., Cardiovascular Res. 53: 31-47 (2002) ; Frangogiannis, N.G. et al., Circulation 98: 687-798 (1998) . 5

El proceso inflamatorio que sigue a la reperfusión es complejo. Inicialmente contribuye al daño miocárdico pero más tarde conduce a la curación y a la formación de cicatriz. Este complejo proceso parece que sucede en dos fases. En la primera llamada también fase "caliente" (dentro de los primeros cinco días) , especies de oxígeno reactivas (en el tejido del miocardio isquémico) y activación complementaria generan una señal quimio táctica para leucocitos 10 (quimio tactismo es el movimiento dirigido de una célula móvil, organismo o parte hacia las condiciones ambientales que considere atractivas y/o el alejamiento de los alrededores de las que encuentra repelentes) e inicia una cascada de citoquinas. Lefer, D.J., Granger, D.N., Am J. Med. 4:315-23 (2000) ; Frangogiannis, N.G., et al., Circulation 7:699-710 (1998) . La degranulación de mastocitos, el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α) , la liberación y aumento de interleucina-6 (IL-6) , la molécula de adhesión intercelular 1 ("ICAM-1 ó CD-54, un receptor típicamente expresado en 15 las células endoteliales y en células del sistema inmunitario) , la selectina (L, E y P) y la expresión de la integrina (CD 11a, CD11b y CD18) todos parecen contribuir a la acumulación de neutrófilos y a la degranulación en el miocardio isquémico. Frangogiannis, N.G. et al., Circulation 7: 699-710 (1998) , Kurrelmeyer, K.M, et al.., Proc. Nat ' l Acad. Sci. 10: 5456-61 (2000) ; Lasky, L.A., Science 258:964-69 (1992) ; Ma, X.L., et al., Circulation 88 (2) : 649-58 (1993) ; Simpson, P.J. et al., J. Clin. Invest. 2: 624-29 (1998) . Los neutrófilos contribuyen significativamente al daño de las 20 células del miocardio y a la muerte a través de la obstrucción micro vascular y la activación de vías de explosión respiratoria neutrofila tras la adhesión ligante-especifica a miocitos cardiacos. Entman, M.L., et al., J. Clin. Invest. 4:1335-45 (1992) . Durante la fase "caliente", la angiogénesis está inhibida debido a la liberación de sustancias angiostáticas, incluyendo la proteína gamma-inducible interferon (IP 10) . Frangogiannis, N.G., et al., FASEB J. 15: 1428-30 (2001) . 25

En la segunda fase, comienza el proceso de reparación cardiaca (alrededor del día 6 a alrededor del día 14) , que eventualmente lleva a la formación de la cicatriz (aproximadamente del día 14 a... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica estéril para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular causada por un infarto de miocardio en un sujeto, estando la composición farmacéutica preparada mediante un proceso que comprende: 5

(a) purificación estéril de una población de células nucleadas comprendiendo células CD34+ obtenidas del sujeto bajo condiciones estériles para producir células CD34+ enriquecidas, en donde las células CD34+ enriquecidas , las cuales además contienen una subpoblación de células potentes CD34+/CXCR-4 que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4, son un producto de células madre hematopoyéticas 10 quimio tácticas

(b) confirmación de que, durante por lo menos 24 horas después de la obtención de dicha población des células nucleadas comprendiendo células CD34+ del sujeto, la subpoblación de células potentes CD34+/CXCR-4, cuando analizadas in vitro después del paso a través de una catéter de por lo menos 0, 36 15 mm de diámetro:

(i) tiene una actividad quimio táctica mediada por CXCR-4;

(ii) puede formar colonias hematopoyéticas; y

(iii) es, por lo menos, un 70% viable; 20

Comprendiendo la composición farmacéutica:

(1) una cantidad terapéutica del autologus aislado estéril producto de células madre hematopoyéticas quimio tácticas obtenido del sujeto y comprendiendo la aislada subpoblacion de células nucleadas 25 enriquecidas para células CD34+, las cuales además contienen una subpoblacion de células CD34+/CXCR-4+ que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4, en donde la cantidad terapéutica del producto de células madre hematopoyéticas quimio tácticas comprende por lo menos 0, 5 x 106 células potentes CD34+/CXCR-4+ que tienen actividad quimio táctica mediada por CXCR-4y es efectiva para tratar la lesión vascular; y 30

(2) una cantidad estabilizante de suero, en donde la cantidad estabilizante de suero es de por lo menos el 10% (v/v) y es efectiva para retener la actividad quimio táctica mediada por CXCR-4 y la actividad de formar colonias hematopoyéticas de la subpoblación de células CD34+/CXCR-4+; en donde la composición farmacéutica es formulada para la administración al sujeto parenteralmente a través de un catéter.

2. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población de células nucleadas comprendiendo células CD34+ está derivada de médula ósea.

3. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo 40 con la reivindicación 1, en donde, durante por lo menos las 48 horas siguientes a la adquisición de la población de células nucleadas cuando analizadas in vitro después del paso a través de un catéter:

(a) las células en la composición son capaces de formar colonias hematopoyéticas in vitro; y

(b) la composición retiene por lo menos un 2% de la actividad quimio táctica mediada por CXCR-4 de la 45 subpoblacion de células potentes CD34+/CXCR-4+ teniendo actividad quimio táctica mediada por CXCR-4.

4. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, durante al menos las 24 horas siguientes a la adquisición de la población de células nucleadas cuando son analizadas in vitro después del paso a través de un catéter: 50

(iv) la composición retiene por lo menos un 2% de la actividad quimio táctica de la subpoblacion de células potentes CD34+/CXCR-4+ teniendo actividad quimio táctica mediada por CXCR-4.

5. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo 55 con la reivindicación 1, en donde la composición es formulada para la administración a través del catéter en el miocardio.

6. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica incluye además por lo menos un agente activo 60 compatible.

7. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población de células nucleadas comprendiendo células CD34+, es derivada de sangre periférica. 65

8. La composición farmacéutica para su utilización en un método de tratamiento de una lesión vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el proceso para la preparación de la composición farmacéutica incluye además:

(c) la evaluación de la esterilidad de la composición farmacéutica mediante los pasos de:

(i) centrifugación del producto celular formulado para formar un producto celular separado comprendiendo un pellet celular comprendiendo la población enriquecida de células CD34+ aisladas y un sobrenadante,

(ii) retirada estéril del sobrenadante del producto celular separado sin disturbar el pellet celular del producto celular separado; y 10

(iii) analizar si el sobrenadante del producto celular separado está contaminado por un microbio, determinando de esta manera la esterilidad del pellet celular del producto celular separado, sin reducción del producto celular separado y

(d) la liberación de la composición farmacéutica estéril como elegible para la infusión en el sujeto, en donde 15 el paso de liberación (d) procede únicamente si la composición farmacéutica estéril es para ser infundida en el sujeto por lo menos alrededor de las 48 horas desde la adquisición de dicha población de células nucleadas del sujeto.