Composiciones de extremo del transposón y métodos para modificar ácidos nucleicos.

Una biblioteca de fragmentos de ADN objeto dirrotulados lineales para la secuenciación,

en donde dicha biblioteca comprende:

1) una pluralidad de fragmentos de ADN objeto bicatenario,

2) una primera cadena transferida fijada al extremo 5' de una porción de la pluralidad de fragmentos de ADN objeto bicatenario por medio de una reacción de transposición que comprende una transposasa, en donde dicha primera cadena transferida comprende una porción 3' que comprende una primera secuencia de extremo de transposón y una porción 5' que comprende un primer dominio de rótulo de secuenciación generando así una pluralidad de fragmentos de ADN rotulados 5', y

3) una segunda cadena transferida fijada al extremo 5' de la cadena complementaria de dichos fragmentos de ADN objeto rotulados 5' por medio de la reacción de transposición que comprende una transposasa, en donde la segunda cadena transferida comprende una segunda secuencia de extremo de transposón y un segundo dominio de rótulo de secuenciación.

Composiciones de extremo del transposón y métodos para modificar ácidos nucleicos Esta solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes provisionales U. S. Nros. de serie 61/108.321, presentada el 24 de octubre de 2008; 61/108.326, presentada el 24 de octubre de 2008; 61/108.329, presentada el 24 de octubre de 2008; 61/155.431, presentada el 25 de febrero de 2009; y 61/184.530, presentada el 5 de junio de 2009.

La presente invención se refiere en general a métodos, composiciones y kits para usar transposasa y composiciones de extremo del transposón para generar una biblioteca de fragmentos lineales de ADN rotulados de ADN objetivo. Los fragmentos de ssADN generados son de utilidad como plantillas, por ejemplo, para una variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, secuenciación de ADN de alto rendimiento, masivamente paralela y/o múltiple.

Antecedentes Hay una variedad de métodos y aplicaciones para los que se desea generar una biblioteca de moléculas de ADN fragmentadas y rotuladas de moléculas objetivo de ADN bicatenario (dsADN) . A menudo, la finalidad consiste en generar moléculas de ADN monocatenario más pequeñas (ssADN) (por ejemplo, fragmentos de ADN) a partir de moléculas de dsADN más grandes para usar como plantillas en reacciones de ADN o ARN polimerasa (por ejemplo, para usar como plantillas en reacciones de secuenciación de ADN o en reacciones de amplificación de ADN o ARN en las que un cebador se funde con el rótulo y se extiende por una polimerasa) .

Hasta recientemente, la mayor parte de las secuenciaciones de ADN se realizó usando el método de secuenciación de terminación de cadena de didesoxi de Sanger, en donde un cebador se extiende por medio de una polimerasa usando el ADN por secuenciar como una plantilla. Se realizan cuatro reacciones, cada una con una mezcla de todos los nucleótidos canónicos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y uno de los cuatro didesoxinucleótidos que terminan en cadena (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP) y cada reacción produce un grupo anidado de fragmentos terminados en cadena que comienzan con el cebador y terminan con el didesoxinucleótido. Cuando estas moléculas de ADN que terminan en cadena se separan por tamaño después de electroforesis, el orden en que los ddNTPs se incorporaron refleja la secuencia del ADN de plantilla. Usando estos métodos, la secuencia se podría determinar para algunos cientos o miles de bases del sitio del cebador. La determinación de secuencias más grandes requerían el empalme de la secuencia más larga junto con la información superpuesta de numerosos clones.

Como estos métodos tradicionales requieren de grandes cantidades de plantilla de ADN y como estos métodos producían pobres resultados si están presentes grandes cantidades de ADN no plantilla, la secuenciación de didesoxi de Sanger se lleva a cabo a menudo usando un ADN clonado o amplificado. Por ejemplo, la mayor parte de la secuenciación llevada a cabo durante el proyecto de genoma humano, que comenzó formalmente en 1990 y culminó con el anuncio de la terminación de un borrador en bruto de la secuencia del genoma humano en 2000 y la publicación de la secuencia del último cromosoma humano en 2006, se basó en el uso de bibliotecas genómicas que consistían en una población de bacterias huésped, cada una de las cuales portaba una molécula de ADN era estaba clonada en un vector de ADN, de modo que la colección de todos los clones de ADN, que llevaba cada uno una parte del ADN genómico, representaba el genoma completo. Este era un proceso tedioso y altamente iterativo, que implicaba la construcción y banca de grandes cantidades de clones de ADN (por ejemplo, clones BAC) , que, a su vez, se subclonaron a menudo para generar bibliotecas de clones de ADN más pequeños que se usaron como plantillas de secuenciación. A menudo, los cebadores usados en estos métodos se diseñaron para fusionarse con el vector de modo tal que se extenderían en el ADN clonado desconocido durante las reacciones de secuenciación. Este enfoque permitió usar el mismo grupo de cebadores para analizar muchos clones diferentes.

A fin de reducir la cantidad de subclonación requerida para el proyecto de secuenciación del genoma humano, un método que a veces se usó era la “transposición in vitro”. El método de transposición in vitro comprende el uso de elementos genéticos móviles denominados transposones para insertar una pequeña porción de ADN de secuencia conocida en el medio del ADN desconocido. El método comprende la incubación de un clon de ADN de una biblioteca genómica con un transposón en condiciones en las que se produce una simple inserción del transposón en el clon de ADN, luego se transforman las células de E. coli con una alícuota de la reacción de transposición in vitro y se seleccionan células que contenían un marcador como un marcador de resistencia a antibióticos, codificados por el transposón. Así, la reacción de transposición in vitro genera una biblioteca de “clones de inserción de transposones” del clon de ADN principal, cada uno de los cuales contiene el transposón insertado en una ubicación diferente en el clon de ADN. Cada clon de inserción se secuencia luego hacia fuera de cada extremo del transposón usando un diferente cebador para cada cadena de ADN. Tal como se describió con anterioridad, la secuencia completa del clon de ADN principal se construye superponiendo las secuencias obtenidas de diferentes clones de inserción. Los ejemplos del uso de este método de inserción de transposones para el proyecto de genoma humano fueron descritos por Butterfield, YSN et al., Nucleic Acids Res 30: 2460-2468, 2002; Shevchenko, Y et al., Nucleic Acids Res 30: 2469-2477, 2002; y Haapa, S et al., Genome Res 9: 308-315, 1999. El uso del proceso de transposición in vitro para el proyecto de genoma humano facilitó la secuenciación completa tanto de clones genómicos de ADN como de clones de cADN generados de mARN codificado por el ADN genómico. Sin embargo, una desventaja de este método de transposición in vitro era que no era totalmente in vitro, dado que requería las

etapas de transformación de células de E. coli, selección de colonias de E. coli que contenían inserciones de transposones y luego aislamiento del ADN de los clones de inserción de transposones para secuenciación.

A fin de eliminar el requerimiento de transformar células de E. coli con una alícuota de la reacción de transposición in vitro y cultivo de las células de E. coli en medio selectivo para obtener clones de inserción de transposones, Teknanen et al. (patente U. S. Nº 6.593.113) desarrolló métodos totalmente a base de transposones in vitro que comprendían una reacción de transposición in vitro y una reacción de amplificación por PCR para seleccionar plantillas de secuenciación. De acuerdo con Teknanen et al., el ADN examinado o el ADN objetivo usado en sus métodos puede variar de algunos pares de bases hasta 40 pares de kilobases, siendo el único factor limitativo para no usar segmentos de ADN aún más largos como ADN objetivo la incapacidad de reacciones de amplificación, como PCR, para amplificar segmentos más largos. Así, en algunas formas de realización, para generar plantillas de secuenciación usando este método, el ADN examinado o ADN objetivo de hasta aproximadamente 40 Kb se somete primero a una reacción de transposición in vitro y luego se amplifica por PCR usando, como un primer cebador de PCR, un cebador fijo que es complementario a una secuencia conocida en el ADN objetivo o, si el ADN objetivo es clonado en un vector, un cebador fijo que es complementario a una secuencia en el vector y como un segundo cebador de PCR, un cebador selectivo que es complementario a una secuencia del extremo del transposón a la que se une el ADN objetivo, más, opcionalmente, uno a diez nucleótidos adicionales de identidad conocida en su extremo 3’. En otra forma de realización, dos cebadores selectivos se usan para la etapa de amplificación por PCR, donde al menos uno de ellos tiene uno a diez nucleótidos adicionales de identidad conocida en su extremo 3’. Los métodos de Teknanen et al. proporcionan ciertos beneficios para la secuenciación de Sanger porque eliminan la necesidad de utilizar células de E. coli para seleccionar moléculas de ADN que tienen inserciones de transposones. Sin embargo, estos métodos están limitados al ADN objetivo de un tamaño de hasta aproximadamente 40 Kb y, debido al uso de cebadores fijos o selectivos, los métodos seleccionan moléculas de ADN que exhiben sólo una parte de las secuencias exhibidas por el ADN objetivo. En consecuencia, a pesar de que estos métodos eran de utilidad para la secuenciación de Sanger, no son apropiados para generar plantillas de secuenciación para novedosos métodos... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca de fragmentos de ADN objeto dirrotulados lineales para la secuenciación, en donde dicha biblioteca comprende:

1) una pluralidad de fragmentos de ADN objeto bicatenario,

2) una primera cadena transferida fijada al extremo 5’ de una porción de la pluralidad de fragmentos de ADN objeto bicatenario por medio de una reacción de transposición que comprende una transposasa, en donde dicha primera cadena transferida comprende una porción 3’ que comprende una primera secuencia de extremo de transposón y una porción 5’ que comprende un primer dominio de rótulo de secuenciación generando así una pluralidad de fragmentos de ADN rotulados 5’, y

3) una segunda cadena transferida fijada al extremo 5’ de la cadena complementaria de dichos fragmentos de ADN objeto rotulados 5’ por medio de la reacción de transposición que comprende una transposasa, en donde la segunda cadena transferida comprende una segunda secuencia de extremo de transposón y un segundo dominio de rótulo de secuenciación.

2. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera y la segunda secuencia de extremo de transposón son iguales.

3. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera y la segunda secuencia de extremo de transposón son diferentes.

4. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer dominio de rótulo de secuenciación también comprende un primer dominio de rótulo de amplificación.

5. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer dominio de rótulo de secuenciación es diferente del segundo dominio de rótulo de amplificación.

6. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo dominio de rótulo de secuenciación también comprende un segundo dominio de rótulo de amplificación.

7. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 4 y 6, en donde el primer dominio de rótulo de amplificación es diferente del segundo dominio de rótulo de amplificación.

8. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha biblioteca es generada por un sistema de transposición in vitro.

9. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha transposasa se seleaciona de una transposasa Mu y una transposasa Tn5.

10. Un método de secuenciación de la biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende:

a) desnaturalizar la biblioteca de fragmentos de ADN dirrotulados lineales para generar una pluralidad de fragmentos de ADN dirrotulados lineales monocatenarios,

b) poner en contacto la pluralidad de fragmentos de ADN dirrotulados monocatenarios con un sustrato en condiciones en las que una porción de los fragmentos se captura en el sustrato, y

c) secuenciar la pluralidad de fragmentos de ADN dirrotulados.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha secuenciación es secuenciación de próxima generación.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha desnaturalización es desnaturalización térmica.

El primer extremo de transposón y el segundo extremo de transposón comprenden el mismo oligonuclótido de extremo de transposón no transferido, pero los oligonucleótidos de extremo de transposón transferidos exhiben diferentes secuencias de rotulación en sus porciones 5’. Este ejemplo ilustra el uso de una secuencia de extremo de transposón bicatenaria para WZ-Tn5TM Transposasa.

Los fragmentos de ADN rotulados en 5’ pueden tener un primer rótulo que comprende o consiste en un oligonucleótido de extremo de transposón transferido que exhibe una secuencia de rótulo arbitraria en su porción 5’. Por ejemplo, si el primer rótulo comprende un rótulo de secuenciación Roche 454A, el segundo rótulo puede comprender el rótulo de secuenciación 454B.