Composición inmunogénica para uso en vacunación contra estafilococos.

Una composición inmunogénica que comprende:

- ClfA aislado o un fragmento inmunogénico del mismo;

y

- toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunogénico de los mismos.

Composiciïn inmunogïnica para uso en vacunaciïn contra estafilococos.

Campo de la tïcnica La presente invenciïn se refiere al campo de las composiciones inmunogïnicas y vacunas contra estafilococos, a su fabricaciïn y al uso de dichas composiciones en medicina. Mïs particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una combinaciïn de antïgenos para el tratamiento o prevenciïn de la infecciïn por estafilococos. Tambiïn se proporcionan procedimientos de uso de dichas vacunas en medicina y procedimientos para su preparaciïn.

Antecedentes El nïmero de infecciones adquiridas en la comunidad y adquiridas en el hospital ha aumentado en los ïltimos aïos con el creciente uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones adquiridas en el hospital (nosocomiales) son una causa principal de morbididad y mortalidad, mïs particularmente en EE.UU., donde afecta a mïs de 2 millones de pacientes anualmente. Tras varios estudios, aproximadamente el 6 por ciento de los pacientes de EE.UU. adquirirï una infecciïn durante su estancia en el hospital. La carga econïmica en EE.UU. se estimï en mïs de 4, 5 billones de dïlares americanos en 1992 (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428) . Las infecciones mïs frecuentes sin infecciones del tracto urinario (ITU, 33 % de las infecciones) , seguidas de neumonïa (15, 5 %) , infecciones en el ïrea quirïrgica (14, 8 %) e infecciones primarias en la circulaciïn sanguïnea (13 %) Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428) .

Los patïgenos nosocomiales mïs importantes son Staphylococcus aureus, estafilococos negativos a la coagulasa (principalmente Staphylococcus epidermidis) , enterococcus spp, Esherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque dichos patïgenos cas producen el mismo nïmero de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producor junto con la frecuencia de los aislados resistentes a antibiïticos equilibran esta clasificaciïn hacia S. aureus y S. epidermidis como los patïgenos nosocomiales mïs significativos.

Staphylococcus aureus es la causa mïs frecuente de infecciones nosocomiales, con una morbididad y mortalidad significativa (Romero-Vivas et al 1995, Infect. Dis. 21; 1417) . Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis sïptica, neumonïa, abscesos y sïndrome del shock tïxico.

S. epidermidis es un comensal normal de la piel que tambiïn es un patïgeno oportunista importrante para las infecciones de dispositivos mïdicos implantados y las infecciones en las zonas de cirugïa. Los dispositivos mïdicos infectados por S. epidermidis inlcuyen marcamasos cardïacos, derivaciones de lïquido cefalorraquïdeo, catïteres para diïlisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopïdicos y prïtesos de vïlculas cardïacas.

Las infecciones producidas por S. aureus y S. epidermidis se tratan con antobiïticos, siendo la penicilina el fïrmaco de elecciïn, mientras que la vancomicina se usa para lis aislados resstentes a meticilina. El porcentaje de cepas de estafilococos que exhiben resistencia de amplio espectro a los antibiïticos se ha convertido en cada vez mïs prevalente desde la dïcada de 1980 (Panlilo et al 1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582) , suponiendo una amenaza para la terapia antimicrobiana eficaz. Ademïs, la reciente apariciïn de la cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha aumentado el miedo de apariciïn y avance de cepas de S. aureus resistentes a meticilina para las que no se dispone de un tratamiento eficaz.

Se ha investigado un enfoque alternativo del uso de antibiïticos contra antïgenos de estafilococos en la inmunoterapia pasiva. Se esta desarrollando una terapia que implica la administraciïn de antisueros policlonales (documento WO 00/15238, WO 00/12132) asï como el tratamiento con un anticuerpo monoclonal contra el ïcido lipoteicoico (documento WO 98/57994) .

Un enfoque alternativo serïa el uso de la vacunaciïn activa para generar una respuesta inmunitaria contra estafilococos. Se han identificado varios candidatos para incluir como componentes de la vacuna. Estos incluyen la proteïna de uniïn a fibronectina (documento US5840846) , anïlogo del MHC II (documento US5648240) , la proteïna de uniïn a fibrinïgeno (documento US6008341) , GehD (documento US 2002/0169288) , la proteïna de uniïn a colïgeno (documento US6288214) , SdrF, SdrG y SdrH (documento WO 00/12689) , SEA mutante y exotoxinas de SEB (documento WO 00/02523) y la proteïna de uniïn a vitronectina de 52kDa (documento WO 01/60852) . Tambiïn se han desarrollado vacunas de mïltiples componentes que comprenden determinadas combinaciones de proteïnas de uniïn bacterianas ("MSCRAMM") . Entre las realizaciones divulgadas en el documento US6703025 se encuentran las composiciones que comprenden el factor de agrupamiento A ("CIfA") o el factor de agrupamiento B ("CLfB") .

Se ha secuenciado el genoma de S. aureus y se han identificado muchas de las secuencias de codificaciïn (documentos EP786519, WO02/094868) . Lo mismo es cierto para S. epidermidis (documento WO 01/34809) . Como perfeccionamiento de este abordaje, otros han identificado proteïnas que son reconocidas por suero hiperinmunitario de pacientes que han sufrido una infecciïn por estafilococos (documentos WO01/98499, WO 02/059148) .

La primera generaciïn de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteïnas que produce han tenido un ïxito limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162) . Existe la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones producidas por estafilococos.

De acuerdo con lo anterior, la presente invenciïn proporciona una composiciïn inmunogïnica que comprende:

• ClfA aislado o un fragmento inmunogïnico del mismo; y

• toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunogïnico de los mismos.

Descripciïn de las figuras Figura 1 – Secuencias polipeptïdicas de proteïnas preferidas. La Tabla 1 proporciona informaciïn sobre quï proteïna estï representada por cada SEC ID.

Figura 2 – Secuencias nucleotïdicas que codifican proteïnas preferidas. La Tabla 1 proporciona informaciïn sobre quï proteïna estï codificada por cada SEC ID.

Figura 3. Purificaciïn de la toxina alfa en condiciones nativas. El panel A muestra un SDS-PAGE teïido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificaciïn de la toxina alfa. Calle 1- marcadores de peso molecular, calle 2 – fracciïn soluble que contiene la toxina alfa sobreexpresada, calle 3 – caudal que atraviesa la columna de Ni-NTA, calle 4 – fracciones eluidas con 10 % de tampïn B, calle 5 – fracciones eluidas con 20 % de tampïn B, calle 6 - fracciones eluidas con 30 % de tampïn B, calle 7 - fracciones eluidas con 50 % de tampïn B, calle 8 - fracciones eluidas con 75 % de tampïn B, calle 9 y 10 fracciones eluidas con 100 % de tampïn B, calle 11 bacterias a T= 0 antes de la inducciïn, calle 12 – bacterias a T= 4 horas tras la inducciïn, calle 13 – lisado celular, calle 14 – fracciïn soluble, calle 15 – fracciïn insoluble. El panel B muestra un SDS-PAGE teïido con azul de Coomassie de 10, 5, 2 y 1 de la toxina alfa purificada.

Figura 4. Purificaciïn de SdrC en condiciones desnaturalizantes. El panel A muestra un SDS-PAGE teïido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificaciïn de la toxina alfa. Clle M- marcadores de peso molecular, calle Inicio- sobrenadante formado a partir de la fracciïn insoluble que contiene SdrC sobreexpresado, calle FT1- caudal a travïs de la columna de Ni-NTA, calle C- fracciones eluidas con tampïn de lavado C, calle D- fracciones eluidas con tampïn D, calle E – fracciones eluidas con tampïn E. El panel B muestra un SDS-PAGE teïido con azul de Coomassie de 1, 2, 5 y 10 ïl del SdrC purificado.

Figura 5 – Resultados de ELISA de antisueros contra proteïnas de estafilococos en placas revestidas con proteïnas purificadas.

Conjunto de ratones antes – resultado usando sueros combinados extraïdos de ratones antes de la inoculaciïn. Conjunto de ratones posterior III – resultado usando sueros de ratïn combinados extraïdos despuïs de la inmunizaciïn. Conjunto de conejos antes – resultado usando sueros combinados extraïdos de conejos antes de la inoculaciïn. Conjunto de conejos posterior III – resultado usando sueros de conejo combinados extraïdos despuïs de la inmunizaciïn. Blc- Control negativo.

Figura 6 – Resultados de ELISA de antisueros de ratïn producidos contra proteïnas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con cïlulas... [Seguir leyendo]

1. Una composiciïn inmunogïnica que comprende:

- ClfA aislado o un fragmento inmunogïnico del mismo; y

- toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunogïnico de los mismos.

2. La composiciïn inmunogïnica de la reivindicaciïn 1, que comprende al menos una proteïna de S. aureus.

3. La composiciïn inmunogïnica de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende al menos una proteïna de S. epidermidis.

4. La composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademïs un polisacïrido o un oligosacïrido PIA y/o polisacïrido u oligosacïrido capsulares de tipo V y/o de tipo VIII de S. aureus.

5. La composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademïs polisacïrido u oligosacïrido capsulares de tipo I y/o de tipo II y/o de tipo II de S. epidermidis.

6. La composiciïn inmunogïnica de las reivindicaciones 4 o 5, en la que el polisacïrido capsular estï conjugado con un vehïculo proteico.

7. La composiciïn inmunogïnica de la reivindicaciïn 6, en la que el vehïculo proteico se selecciona de toxoide del tïtanos, toxoide diftïrico, CRM197, proteïna D de Haemophilus influenzae, neumolisina y toxoide alfa.

8. La composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de generar una respuesta inmunitaria eficaz tanto contra S. aureus como contra S. epidermidis.

9. Una vacuna que comprende la composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacïuticamente aceptable.

10. Un procedimiento de preparaciïn de una vacuna, que comprende las etapas de mezclar antïgenos para preparar la composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y aïadir un excipiente farmacïuticamente aceptable.

11. Uso de la composiciïn inmunogïnica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricaciïn de una vacuna para el tratamiento o la prevenciïn de infecciïn por estafilococos.

Anti-Isa A

Anti-Isa A

Anti-Isa A