Clonación, expresión de levaduras, purificación y actividad biológica de la región de extensión de la subunidad alfa'' de la globulina 7S de soja involucrada en la homeostasis del colesterol de células Hep G2.

Fragmento hidrófilo N-terminal de la subunidad α' de la Globulina 7S de soja que consiste en 142 restos de aminoácidos de dicho lado N-terminal.

Clonación, expresión de levaduras, purificación y actividad biológica de la región de extensión de la subunidad alfa’ de la globulina 7S de soja involucrada en la homeostasis del colesterol de células Hep G2

La presente invención se refiere a un fragmento a’ recombinante de la globulina 7S de soja que corresponde al fragmento hidrófilo N-terminal de la subunidad a’ natural que consiste en 142 restos de aminoácidos de dicho lado N-terminal, a un procedimiento para su preparación y a composiciones que lo contienen como un principio activo útil para el control de la homeostasis del colesterol y los triglicéridos.

Antecedentes de la invención El papel de las proteínas de soja en la dieta en el control de niveles lipidémicos de pacientes hipercolesterolémicos es un tema ampliamente aceptado [1]. En estudios anteriores [2-4], la participación directa de una subunidad de la globulina 7S de soja, la subunidad a’, en la regulación positiva del receptor de LDL se demostró en sistemas in vitro e in vivo, sugiriendo que los (poli) péptidos biológicamente activos, capaces de modular la homeostasis del colesterol, se producen posiblemente por procesamiento enzimático celular.

La globulina 7S nativa se compone de tres cadenas polipeptídicas distribuidas al azar, las subunidades a’, a y º [5], codificadas por genes diferentes. Las cadenas maduras a’ (Registro N. P11827 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) y a (Registro N. P13916 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) comparten una región Nterminal extendida de aproximadamente 145 restos de aminoácidos que no se encuentra en la subunidad º (Registro N. P25974 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) . Basándose en la secuencia de aminoácidos peculiar de la región de extensión a’, esta subunidad se purificó por cromatografía de afinidad metálica y se administró por vía oral a ratas hipercolesterolémicas, permitiendo de este modo mostrar sus propiedades tanto hipolipemiantes en plasma como de regulación positiva de receptores hepáticos de º-VLDL [4]. Por otro lado, ya que el peso molecular de la subunidad a’ es de aproximadamente 71 kDa [6], parece poco probable que pueda atravesar in vivo la barrera intestinal sin modificación alguna.

Por esta razón, nuestra investigación se ha dirigido a la búsqueda de la secuencia (o secuencias) de aminoácidos de la subunidad a’ responsable del efecto farmacológico. Dado que las regiones centrales de las tres subunidades tienen secuencias de aminoácidos más parecidas, es concebible que la actividad biológica resida en uno o más (poli) péptidos de la región de extensión. En principio, las diferencias localizadas, aunque significativas, de aminoácidos entre las regiones de extensión de las cadenas a’ y a limitarían el número de péptidos responsables de la actividad biológica.

A partir de estas declaraciones anteriores, la primera estrategia seguida fue ensayar el efecto de ambos polipéptidos en células Hep G2, obtenidas a partir de la digestión in vitro (pepsina/tripsina) de CroksoyR70, un concentrado de soja que carece de isoflavonas empleado rutinariamente en el tratamiento dietético de pacientes hipercolesterolémicos [7-8], y péptidos sintéticos, que corresponden a secuencias de aminoácidos específicas que difieren entre las subunidades de la globulina 7S de soja, en la modulación del receptor de LDL (LDL-R) . Los resultados obtenidos en estos estudios indicaron que podría inducirse una regulación positiva de LDL-R marcada en células HepG2 expuestas a productos de digestión enzimática de CroksoyR70 con un PM que varía de 3.000 a 20.000 Da, así como a un pequeño péptido sintético (2.271 Da) de la globulina 7S de soja que se añadió a las células a una concentración de 10-4M [9]. El estudio obtenido con pequeños péptidos continúa investigándose actualmente y hasta ahora no ha sido concluyente [10].

La capacidad reductora de colesterol y triglicéridos de las proteínas de soja es un tema consolidado. La dieta de proteína de soja es actualmente la herramienta dietética más potente para tratar a los pacientes hipercolesterolémicos, proporcionando así una oportunidad única para el tratamiento de adultos y sujetos muy jóvenes. Además, se ha establecido claramente que la reducción del colesterol en plasma es mayor en pacientes que tienen un alto grado inicial de colesterolemia [14].

La hipótesis de que las proteínas reducen de por sí el colesterol en sangre surgió de estudios experimentales que indicaban que un cambio de proteínas animales a vegetales en la dieta activaba el sistema receptor de LDL en el hígado de animales de laboratorio [15], así como en linfomonocitos circulantes de pacientes hipercolesterolémicos [16]. Para identificar los componentes de la proteína de soja responsables del efecto reductor del colesterol, se realizaron estudios in vitro con una línea celular de hepatoma humano que es altamente sensible a factores que regulan la expresión del receptor de LDL y a la biosíntesis/degradación del colesterol. La subunidad a’ purificada de la globulina 7S de soja resultó que regulaba positivamente a los receptores de LDL en células Hep G2 [3] y este descubrimiento se confirmó en ratas alimentadas con altos niveles de colesterol [4]. Aunque estos datos apoyan la hipótesis que la fracción de proteína es responsable del efecto biológico observado, se pueden plantear argumentos del destino biológico in vivo de la cadena a ’, ya que los péptidos y los aminoácidos se producen normalmente por la acción de enzimas proteolíticas gástricas y/o intestinales. Sin embargo, un número creciente de (poli) péptidos de animales y plantas afirma que juegan funciones relevantes de regulación, a menudo atribuidas a efectos antioxidantes, anti-proliferativos y anti-inflamatorios [17]. En lo que se refiere a la soja, la evidencia experimental indica claramente la posibilidad de que puedan adsorberse péptidos e incluso pequeñas proteínas compactas, tales como el inhibidor de Bowman-Birk, [18], provocando así diversos efectos, que incluyen los anti-cancerígenos, antiinflamatorios y los radio-protectores [19]. Se ha demostrado que los (poli) péptidos de la soja modificada genéticamente también desencadenan respuestas biológicas, tales como efectos hipotensores [20]. Recientemente, se ha identificado un péptido estimulador de la transcripción de LDL-R (FVVNATSN) , que deriva de la cadena de la globulina 7S, a partir de un hidrolizado de soja preparado por una proteasa de Bacillus amyloliquefaciens y después por síntesis química [21].

En este caso, se detectó un aumento de la transcripción de LDL-R (+148%) en células Hep G2 expuestas al péptido a una concentración de 100 μM. Otros péptidos derivados de la globulina 11 S han demostrado ejercer una actividad similar pero más baja [21].

El documento WO 03/063608 [24] muestra una subunidad alfa de la globulina 7S de soja truncada, que comprende el lado N-terminal de la subunidad alfa’ natural que tiene un peso molecular de 28.000 Da, que se procesa para la preparación de los mismos y las composiciones que contienen el fragmento.

Lovati M. y col. [25] hacen referencia a la actividad biológica de una forma truncada de la subunidad alfa de la globulina 7S de soja (ta’) en la homeostasis del colesterol celular.

Sería deseable elaborar polipéptidos más cortos manteniendo o incluso mejorando las propiedades biológicas de la proteína de longitud completa.

Descripción de la invención Ahora se ha descubierto que la denominada Región de Extensión a’ del lado N-terminal de la globulina 7S de soja que corresponde a su lado N-terminal, que consiste en 142 restos de aminoácidos del mismo, tiene actividad biológica ventajosa y ha demostrado ser incluso más eficaz en la captación y degradación del LDL en comparación con la cadena a’ de tamaño completo.

La invención proporciona por lo tanto dicha Región de Extensión a’, a la cual se hará referencia en lo sucesivo como ea’, así como un proceso para su preparación mediante clonación, expresión de levaduras y purificación del polipéptido recombinante que contiene la región de extensión N-terminal de una subunidad a’ de la soja.

Para este propósito se llevó a cabo la expresión heteróloga del fragmento N-terminal de la cadena a’. El objetivo se logró en células de levadura de secreción competente de la levadura Pichia pastoris. Se purificó el polipéptido recombinante y su actividad biológica se evaluó en células HepG2. Mediante el uso de este enfoque biotecnológico, se pueden obtener cantidades adecuadas del polipéptido recombinante para ensayar en pruebas in vitro... [Seguir leyendo]

1. Fragmento hidrófilo N-terminal de la subunidad a’ de la Globulina 7S de soja que consiste en 142 restos de aminoácidos de dicho lado N-terminal.

2. El fragmento hidrófilo N-terminal de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la SEC ID 1.

3. Un procedimiento de preparación del fragmento hidrófilo N-terminal de la Globulina 7S de soja de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la clonación, la expresión en Pichia pastoris y la purificación del polipéptido recombinante.

4. Composiciones que comprenden, como principio activo, el fragmento hidrófilo N-terminal de la globulina 7S de 10 soja de las reivindicaciones 1 o 2 en mezcla con un vehículo adecuado.