Células madre de Müller.

Procedimiento para la producción de células de la reina, útiles para el tratamiento de trasplante,

que comprende las etapas de:

(i) haber obtenido in vitro una o varias células de Müller adultas de humano que expresan la proteína de fijación al retinaldehído celular y la vimentina; y

(ii) cultivar las células en presencia de una proteína de la matriz extracelular seleccionada entre matrigel, fibronectina, colágeno, vitronectina y laminina, y un factor de crecimiento seleccionado entre EGF o FGF-2 para desdiferenciar las células en células que expresan al menos uno de los marcadores de célula progenitora seleccionados entre nestina, proteína sonic hedgehog, tubulina ßIII, Shh, Sox-2 y Chx10, mediante lo cual las células de Müller se vuelven inmortales

Células madre de Müller Campo de la invención

La presente invención se refiere a la restauración de la función visual mediante el trasplante de células. En particular, la presente invención se refiere al uso de células madre de Müller adultas para el tratamiento de trastornos visuales y trastornos neurológicos.

Antecedentes de la invención

La restauración de la función visual es uno de los objetivos fundamentales en la investigación de la visión. Los tratamientos actuales para las enfermedades graves que conducen a ceguera, tal como la degeneración macular relacionada con la edad (DME), el glaucoma, la retinopatía diabética y las complicaciones del desprendimiento de retina, son sólo sintomáticos o frenan la progresión de la enfermedad, pero no restauran la función visual. Las investigaciones recientes que implican el trasplante de las células madre en un amplio espectro de enfermedades han entusiasmado a la comunidad médica y científica, y las investigaciones con células madre para restaurar los circuitos neurales de las retinas enfermas se ven alentadas por los resultados obtenidos con el trasplante de células progenitores para tratar otras enfermedades humanas, entre ellas leucemia, quemaduras serias de la piel y disfunción del miocardio.

Hasta la fecha, los estudios sobre el trasplante destinados a la restauración de la función de la retina humana han tenido poco éxito, y se han limitado al trasplante de células del epitelio pigmentario de la reina (EPR) y de células del epitelio pigmentario del Iris (EPI). El trasplante experimental de EPR, de células de Schwann y de células precursoras procedentes del cerebro en los modelos animales de degeneración retiniana ha proporcionado cierto éxito a la hora de conservar la función de la retina. El trasplante retlnlano de células precursoras procedentes del cerebro a ratas RCS (un modelo de degeneración retiniana) favorece la supervivencia de las células fotorreceptoras. Sin embargo, aunque las células trasplantadas migran a la capa de células fotorreceptoras, no logran expresar los marcadores neurales de la retina, lo que sugiere que se necesita un precursor neuronal específico para la regeneración funcional y morfológica de la retina.

En los primeros estudios se pensaba que las células madre podían aislarse sólo de los embriones, por lo cual los cías células progenitores neurales se identificaron primero en el sistema central y en el sistema nervioso periférico (SNC y SNP) de los embriones de mamíferos. Sin embargo, las investigaciones más recientes han identificado células madre adultas en regiones neurógenas del SNC, y esto ha impulsado más estudios en busca de células madre adultas.

Llmb et al., IOVS, 22; 43 (3); 864-869 describen la identificación de células de Müller inmortalizadas de manera espontánea.

Las células de Müller son neurogliocitos radiales que atraviesan en vertical todo el espesor de la retina. Estabilizan la compleja arquitectura retiniana, dan soporte metabóllco y estructural a las neuronas y a los vasos sanguíneos, impiden la migración aberrante de los fotorreceptores al espacio subretiniano y regulan el transporte de líquidos entre la cavidad vitrea y el espacio subretiniano. Casi todas las afecciones patológicas de la retina que constituyen las causas principales de ceguera, entre ellas la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética proliferativa, la vltreorretlnopatía proliferativa (VRP) y la retinitis pigmentaria (RP) están asociadas a cambios en la distribución, proliferación o funcionamiento de las células de Müller.

En Fischer et al., Nature Neuroscience, 21; 4(3): 247-252 se describe la identificación de los neurogliocitos de Müller obtenidos de la retina de pollos posnatales. Se demuestra que los neurogliocitos de Müller no están diferenciados, proliferan y expresan factores de transcripción que se expresan normalmente en las células progenitores de la retina embrionaria. Los neurogliocitos de Müller proliferan en respuesta a daños en la retina.

En Tropede et al. (Science (2) 287, páginas 232-236) se describen los estudios en ratones de 2 a 3 meses de edad y se presenta la identificación de una célula madre en el ojo del ratón.

En Ahmad et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. (2) 27, páginas 517-521) se describe la caracterización de las células progenitores neurales aisladas del ojo de mamífero (rata) adulto.

En el ojo humano se ha demostrado que, durante el desarrollo fetal, se encuentran células madre de Müller que dan origen a diferentes células de la retina, pero no hay pruebas todavía de que estas células puedan estar presentes en la retina neural adulta.

En Guidry et al. (IVOS, vol. 44, n.° 3, marzo de 23 (23-3), páginas 1355-1363) se describe un estudio para

valorar la capacidad que tienen las células de Müller humanas para generar fuerzas de la tracción y para determinar la función que desempeñan los factores de crecimiento y las integrinas de fijación al colágeno en este proceso.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar células adecuadas para ser usadas en los tratamientos de trasplante de células de la retina, para el tratamiento de los daños de la retina humana.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en la realización de que se pueden obtener células de Müller de la retina neural adulta de los humanos y hacer que se comporten como células madre en las condiciones adecuadas.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, un procedimiento para producir células de la retina, útiles en el tratamiento de trasplante, comprende las etapas de:

(i) obtener in vitro una o varias células de Müller adultas de humano que expresan la proteína de fijación al retinaldehído celular y la vimentina; y

(¡i) cultivar las células en presencia de una proteína de la matriz extracelular seleccionada entre matrigel, fibronectina, colágeno, vitronectina y laminina, y un factor de crecimiento seleccionado entre EGF o FGF-2 para desdiferenciar las células en células que expresan al menos uno de los marcadores de célula progenitora seleccionados entre nestina, proteína sonic hedgehog, tubulina (3111, Shh, Sox-2 y Chx1, por medio de lo cual las células de Müller se han vuelto inmortales.

La capacidad de tomar células de Müller adultas de mamífero y tratarlas para Inducir la desdiferenciación permite obtener gran cantidad de células y utilizarlas para el tratamiento de trasplante. Las células producidas de acuerdo con el procedimiento de la Invención se ha demostrado que conservan la Integridad de la reina y atenúan la pérdida de la función visual cuando se Inyectan en el espacio subretlnlano de las ratas RCS.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, las células de la retina que se pueden obtener de acuerdo con el procedimiento esbozado anteriormente se utilizan para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada a la pérdida de células o al daño de las células.

Descripción de los dibujos

La invención se describe en relación con los dibujos acompañantes, en donde:

La figura 1 es una representación fotográfica de las células de Müller, bien (A) en placas de plástico de cultivo de tejidos, (B) en placas de plástico de cultivo de tejidos que muestran microvellosidades características, y (C) que muestran las proyecciones de las placas motoras;

La figura 2 es una representación fotográfica de las células de Müller que crecen en diferentes condiciones de cultivo;

La figura 3 es una representación fotográfica de los cultivos de las células de Müller en distintas condiciones; en donde (A) muestra la expresión de la ciclina D y (B) muestra la fijación a la aglutinina de cacahuete;

La figura 4 es una representación fotográfica de la expresión de los marcadores neurales retiñíanos de las células de Müller cultivadas sobre matrigel en presencia de ácido retinoico;

La figura 5 es una representación fotográfica de la expresión de los marcadores neurales retiñíanos en las células de Müller cultivadas sobre matrigel en presencia de FGF2 y IGF-1;

La figura 6 es una representación fotográfica de las células de Müller trasplantadas en las ratas RCS, y muestra el aspecto de la retina transcurridos 4 meses después del trasplante;

La figura 7 es una representación fotográfica de las células de Müller trasplantadas en el espacio subretiniano de una rata RCS, en la que se identifican las células con anticuerpos contra marcadores; y

La figura 8 es una representación gráfica de la respuesta a estímulos visuales de una rata RCS después del trasplante con las... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de células de la reina, útiles para el tratamiento de trasplante, que comprende las etapas de:

(i) haber obtenido in vitro una o varias células de Müller adultas de humano que expresan la proteína de fijación al retinaldehído celular y la vimentina; y

(ii) cultivar las células en presencia de una proteína de la matriz extracelular seleccionada entre matrigel, fibronectina, colágeno, vitronectina y laminina, y un factor de crecimiento seleccionado entre EGF o FGF-2 para desdiferenciar las células en células que expresan al menos uno de los marcadores de célula progenitora seleccionados entre nestina, proteína sonic hedgehog, tubulina (3III, Shh, Sox-2 y Chx1, mediante lo cual las células de Müller se vuelven inmortales.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de la matriz extracelular es la fibronectina y el factor de crecimiento es el EGF.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde las células desdiferenciadas se cultivan adicionalmente en presencia de una proteína de la matriz extracelular seleccionada entre matrigel, fibronectina, colágeno o laminina, y los agentes de diferenciación se seleccionan entre FGF-2, ácido retinoico, 3,3',5-triyodo-L-tironina, insulina, factor de crecimiento de tipo insulina o TGFp, para así inducir a las células desdiferenciadas a que adopten un fenotipo de célula neural diferenciada y específica.

4. Utilización de una célula retiniana humana que se puede obtener mediante un procedimiento como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada a la pérdida de las células o al daño celular, en donde el procedimiento comprende las etapas de:

(i) haber obtenido in vitro una o más células de Müller adultas de humano que expresan la proteína de fijación al retinaldehído celular y la vimentina; y

(ii) cultivar las células en presencia de una proteína de la matriz extracelular seleccionada entre matrigel, fibronectina, colágeno, vitronectina y laminina, y un factor de crecimiento seleccionado entre EGF o FGF-2 para desdiferenciar las células en células que expresan al menos uno de los marcadores de célula progenitora seleccionados entre nestina, proteína sonic hedgehog, tubulina (3III, Shh, Sox-2 y Chx1, mediante lo cual las células de Müller se vuelven inmortales.

5. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la célula retiniana es una célula madre pluripotente de Müller.

6. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde la afección está asociada a pérdida de células o al daño en un ojo humano.

7. Utilización de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 6, en donde la afección a tratar se selecciona del grupo que consiste en: degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética proliferativa, vitreorretinopatía proliferativa, desprendimiento de retina, retinitis pigmentaria, glaucoma y lesión del nervio óptico y degeneración.

8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde las células son células autólogas, procedentes del paciente a tratar, células heterólogas almacenadas en un banco de células o células modificadas genéticamente procedentes del paciente o de un banco de células.