Células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de células madre.

Un método de inducción de la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas en células del epitelio pigmentario de la retina,

método que comprende:

a. cultivar células madre pluripotentes humanas en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con nicotinamida (NA) para generar células en diferenciación; y

b. cultivar dichas células en diferenciación en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con uno o más miembros de la superfamilia de factores de crecimiento de transformación TGFβ, mediante lo que dichas células madre pluripotentes humanas son inducidas a la diferenciación en células RPE.

Células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de células madre CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos y a sistemas de producción de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) diferenciadas y a usos terapéuticos de las células RPE así obtenidas.

LISTA DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La siguiente lista es una lista de referencias que se consideran relevantes para describir el estado de la técnica en el campo de la invención.

(1) Strauss O., The retinal pigment epithelium in visual function; Physiol. Rev. 85: 845-881, 25.

(2) Lund R. D. et al., Cell transplantation as a treatment for retinal disease; Prog Retín Eye Res 2: 415-449, 21.

(3) Haruta M., Embryonic stem cells: potential source for ocular repair; Semin Ophthalmol. 2(1):17-23, 25.

(4) Haruta M. et al., In vitro and in vivo characterization of pigment epithelial cells differentiated from primate embryonic stem cells; Invest Ophthalmol Vis Sci 45:12-124,24.

(5) Aoki H. et al., Embryonic stem cells that dlfferentlate ¡nto RPE cell precursors in vitro develop into RPE cell monolayers in vivo', Exp Eye Res. 82(2):265-274, 26.

(6) Klimanskaya I. et al., Derlvatlon and comparatlve assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells uslng transcrlptomlcs; Cloning Stem Cells 6(3):217-245, 24.

(7) Lund R. D. etal., Human embryonic stem cell-derlved cells rescue visual function ¡n dystrophlc RCS rats; Cloning Stem Cells 8(3): 189-199, 26.

(8) Publicación de la solicitud PCT N° WO 6/737.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La disfunción, el daño y la pérdida de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) son características destacadas de ciertas enfermedades y trastornos oculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), degeneraciones maculares hereditarias Incluyendo la enfermedad de Best (la forma de aparición temprana de la distrofia macular viteliforme) y subtipos de retinitis pigmentosa (RP). Un posible tratamiento para dichas enfermedades es el trasplante de RPE (y fotorreceptores) en la retina de los afectados por las enfermedades. Se cree que la reposición de las células RPE mediante trasplante puede retrasar, detener o revertir la degeneración, mejorar la función de la retina y prevenir la ceguera derivada de dichas afecciones.

La mácula, la parte central de la retina, es responsable de la percepción de detalles visuales nítidos y del color, y es fundamental para muchas de nuestras tareas visuales diarias tales como el reconocimiento facial y la lectura. La mácula a menudo se ve afectada como parte del proceso patológico en las degeneraciones retinianas extendidas tales como la retinitis pigmentosa (RP), así como en diferentes enfermedades que se dirigen más específicamente a la región macular, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y la enfermedad de Best. En muchas de estas enfermedades, la disfunción e Insuficiencia primaria se produce en células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que subyacen a los fotorreceptores.

Las células RPE altamente especializadas desempeñan un papel Importante en la función fotorreceptora de apoyo: transportan activamente nutrientes desde los vasos de la coroides, participan en el reciclaje de la vitamina A, que es necesaria para los cromóforos de los fotorreceptores, y absorben y reciclan los segmentos externos de fotorreceptor desprendidos como parte del proceso de renovación normal de estas células1.

En los subtipos de RP, la enfermedad de Best y la AMD, la Insuficiencia de las RPE conduce, en última Instancia, a la pérdida de visión y ceguera. La sustitución de estas células es una posible Intervención terapéutica2, pero la obtención de dichas células de donantes o embriones humanos es difícil. Las células madre embrionarias humanas (hESC) pueden servir como posible fuente donante ¡limitada de células RPE, siempre que se puedan dilucidar los medios para dirigir su diferenciación en células RPE funcionales3. Ya se han descrito métodos para dirigir la diferenciación de las hESC en cultivos altamente enriquecidos en células precursoras neuronales (NP) (Reublnoff B. E. et al., Neuronal progenitors from human embryonic stem cells; Nat Biotechnol 19: 1134-114, 21; Itsykson P. et al., Derivation of neuronal precursors from human embryonic stem cells ¡n the presence of noggln; Mol Cell Neurosci. 3(1):24-36, 25). Además, se ha demostrado el potencial de las hESC para dar lugar a células de la retina tanto in vitro como in vivo tras el trasplante en el espacio subretlnlano de roedores (Banin E. et al., Retinal Incorporaron and Differentiatlon of Neuronal Precursors Derlved from Human Embryonic Stem Cells; Stem Cells 24(2):246-257, 26).

Se ha demostrado el potencial de las ESC murlnas y de primate no humano para diferenciarse en células RPE, y sobrevivir y atenuar la degeneración de la retina después del trasplante4,5. Se ha observado la diferenciación

espontánea de las células hESC en células RPE. Sin embargo, la eficacia del proceso de diferenciación fue baja, requiriéndose un tiempo de diferenciación considerable y obteniéndose solo un bajo porcentaje (<1 %) de agrupaciones que contenían células RPE tras 4-8 semanas de diferenciación. Además, aunque se observó una mejor función de la retina en ratas RCS tras el trasplante subretiniano de estas células RPE, no se demostró la función de las células trasplantadas como auténticas células RPE maduras, y este efecto se podría relacionar con un efecto trófico inespecífico del RPE6,7,9,1.

También se ha demostrado recientemente que es posible dirigir las células hESC para que se diferencien de forma reproducible en células RPE, produciéndose la diferenciación dirigida en lugar de espontánea de las hESC en células RPE en presencia de nicotinamida (NA)8.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un miembro de la superfamilia de los factores de crecimiento de transformación-p (TGFp) en la preparación de un sistema de cultivo para potenciar la diferenciación dirigida y aumentada de células madre humanas (hSC) en células del epitelio pigmentario de la retina (RPE).

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para potenciar la diferenciación dirigida de las hSC en células RPE, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un cultivo celular que comprende células hSC; y

(b) cultivar las células de dicho cultivo celular en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, mediante lo que dichas células hSC son inducidas a la diferenciación dirigida en células RPE.

De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un cultivo celular que comprende células RPE obtenidas mediante la diferenciación dirigida de las hSC en presencia de uno o más miembros de la superfamilia de TGFp. Preferentemente, las células RPE son células RPE diferenciadas terminalmente (maduras) obtenidas mediante el método desvelado en el presente documento. Como se mostrará en el presente documento, dichas células RPE presentan varios rasgos característicos que son diferentes de los obtenidos cuando las hSC se diferencian de forma espontánea en células RPE. Preferentemente, las células RPE son capaces de responderá la señalización de TGFp durante su diferenciación.

De acuerdo con un cuarto aspecto, se desvela un método de trasplante de células RPE derivadas de células hSC en el ojo de un sujeto, obteniéndose dichas células RPE por diferenciación dirigida de dichas células hSC, método que comprende

(a) proporcionar un cultivo celular que comprende las células hSC;

(b) cultivar dicho cultivo celular en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, mediante lo que dichas hSC son Inducidas a diferenciarse en células RPE;

(c) recoger de dicho cultivo celular células RPE; y

(d) trasplantar dichas células RPE en el ojo de dicho sujeto.

De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona un sistema de cultivo celular que comprende células RPE derivadas de células hSC trasplantares obtenidas mediante la diferenciación dirigida de dichas células hSC. Las células RPE trasplantadas presentaron uno o más parámetros indicativos de que dichas células trasplantadas son funcionales en el ojo de dicho sujeto. La funcionalidad de las células RPE trasplantadas se muestra por su capacidad de absorción de segmentos externos de fotorreceptor desprendidos en paralelo a la mejora de la función retlnlana.

Las células hSC... [Seguir leyendo]

1. Un método de inducción de la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas en células del epitelio pigmentario de la retina, método que comprende:

a. cultivar células madre pluripotentes humanas en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con nicotinamida (NA) para generar células en diferenciación; y

b. cultivar dichas células en diferenciación en un sistema de cultivo que comprende un medio básico suplementado con uno o más miembros de la superfamilia de factores de crecimiento de transformación TGFp,

mediante lo que dichas células madre pluripotentes humanas son inducidas a la diferenciación en células RPE.

2. El método de la reivindicación 1

en el que dicho cultivo de células madre pluripotentes humanas en un sistema de cultivo que comprende dicho medio básico suplementado con dicha NA se efectúa durante al menos dos días.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho miembro de la superfamilia de TGFp es TGFpi, TGFp3 o activina A.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células madre pluripotentes humanas 2 son células madre embrionarias humanas.