Celdilla de digestión-lixiviación con membrana semipermeable, sistema de cerrado hermético y de control de temperatura.

La invención es una celdilla de digestión-lixiviación con membrana semipermeable,

sistema de cerrado hermético y de control de temperatura que es un dispositivo para pruebas de digestibilidad y lixiviación de moléculas o iones a nivel laboratorio.

La invención es un diseño novedoso que permite mantener aislada la cámara interna (donde se realiza la digestión-lixiviación de materiales) de la cámara externa (donde se reciben los productos de la digestión-lixiviación) conectadas exclusivamente a través de la membrana semipermeable, de tamaño de poro intercambiable, para el paso de las moléculas o iones de tamaño deseado. La celdilla contiene un dispositivo que permite mantener un control de la temperatura en el interior de la cámara interna.

Las aplicaciones de la celdilla están en laboratorios académicos o de investigación (empresas, centros de investigación, institutos, Universidades) para la realización de pruebas de digestibilidad in vitro de macromoléculas o de lixiviación de moléculas o iones.

Celdilla de digestión-lixiviación con membrana semipermeable, sistema de cerrado hermético y de control de temperatura.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La presente invención se encuadra en los sectores de agroalimentación y salud, concretamente en nutrición y alimentación, como es la evaluación preliminar de la biodisponibilidad de proteína y carbohidratos en ingredientes y piensos para acuicultura.

Los sectores química y farmacia también entrarían dentro del campo de aplicación de la 10 invención, concretamente la evaluación de la lixiviación o liberación de moléculas solubles a partir de comprimidos o materiales que contengan moléculas solubles.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La primera descripción de los parámetros operativos y las características estructurales de un 15 sistema de digestibilidad in vitro basado en el empleo de una membrana de diálisis es publicada en 1986 por L. Savoie y S.F. Gauthier en dos trabajos de la misma revista:

Savoie L & Gauthier SF. 1986 Dialysis cell for the in vitro measurement of protein digestibility. J. Food Science, 51 (4) :494-498. 20

SF Gauthier, C. Vachon & L. Savoie 1986. Enzymatic conditions of an in vitro method to study protein digestion. J. Food Science, 51 (4) : 960-964.

En dichos trabajos se describe la posibilidad de utilizar una celda formada por dos vasos. El 25 vaso interno está rodeado por una membrana tubular con un capacidad de separación de 1000 Da y está incluido en un compartimento externo provisto de una circulación constante de tampón. Los trabajos describen las dimensiones de los compartimentos y membrana, así como la tasa de flujo del tampón circulante más idónea para garantizar una adecuada difusión de los productos de la hidrólisis de proteína. En este sistema, se utiliza siempre pancreatina comercial 30 como fuente de enzimas para la hidrólisis de proteína.

Este mismo sistema ha sido utilizado posteriormente para evaluar la capacidad de hidrólisis proteica de las enzimas presentes en extractos semipurificados del intestino de peces. Los resultados se resumen en: 35

Moyano, F.J. & Savoie, L. 2001. Comparison of in vitro systems of protein digestion using either mammal or fish proteolytic enzymes. Comp.Biochem. Physiol. A 128: 359-368.

Una modificación del dispositivo descrito en los trabajos anteriores, en el que se reducen el 40 número de piezas de la celdilla y se modifican ligeramente sus dimensiones se aplicó para un estudio más detallado de algunos de los parámetros aplicables al estudio de la digestión en peces por:

Mariam Hamdan, Francisco J Moyano and Dominique Schuhardt. 2009 Optimization of a 45 gastrointestinal model applicable to the evaluation of bioaccessibility in fish feeds J Sci Food Agric 2009; 89: 1195-1201.

Aún sobre este modelo se han realizado algunas otras modificaciones relacionadas fundamentalmente con la inclusión en la tapa de la celdilla de huecos provistos de cierre que 50

permiten tanto la colocación de una sonda de temperatura como la toma de muestras de la cámara interna de reacción (delimitada por la membrana) . Esto ha permitido ampliar el número de parámetros a muestrear, como por ejemplo la solubilización de la proteína durante el curso de la reacción, tal y como se describe en:

Morales, G. & Moyano, F.J. 2010 Application of an in vitro gastrointestinal! model to evaluate nitrogen and phosphorus bioaccessibility and bioavailability in fish feed ingredients- Aquaculture 306; 244-251.

Por otra parte, otros autores también han empleado la membrana de diálisis para simular el 10 compartimento intestinal durante la digestión de proteínas y permitir la separación de los productos, aunque la configuración utilizada no responde exactamente al modelo de celdilla descrito anteriormente. Tal sería el caso del trabajo publicado por:

Ph. Gatellier & V. Santé-Lhoutellier. 2009: Digestion study of proteins from cooked meat using 15 an enzymatic microreactor. Meat Science 81: 405-409.

Gatellier y Santé-Lhoutellier describen un microrreactor enzimático provisto de dos compartimentos; la etapa gástrica se lleva a cabo en una celdilla de 65 mm de diámetro interno provista de una membrana de poliéter sulfona con un tamaño se selección de 10 KDa. La 20 celdilla está colocada sobre un agitador magnético y sumergida en un baño termostatizado y está conectada a una bomba peristáltica que hace recircular constantemente el contenido de la misma. La etapa alcalina se simula incluyendo 15 ml de la solución predigerida en el dispositivo anteriormente descrito conjuntamente con una mezcla enzimática en una membrana de celulosa con tamaño de selección de 1 KDa. Esta membrana está sumergida en un vaso de 25 25 ml que contiene un tampón termostatizado. La solución tampón es recirculada constantemente mediante dos bombas peristálticas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Las celdillas descrita hasta el momento, no se encuentran fácilmente disponibles en el mercado 30 y requieren experiencia en el usuario para garantizar el armado correcto y el sellado de la cámara interna mediante la sujeción de la membrana semipermeable a las paredes de la cámara interna; además de que carecen de un sistema de control de temperatura interno (dentro de la cámara interna donde se desarrolla la digestión o lixiviación) .

La celdilla de digestión propuesta en nuestra invención, incorpora un nuevo diseño, sobresaliendo su sistema de cerrado hermético y de control interno de temperatura de reacción en la cámara interna, donde se realiza el proceso de digestión in vitro y de lixiviación de moléculas solubles. La celdilla tiene aplicabilidad para medir la digestión de proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos u otras biomoléculas digestibles, y la liberación de péptidos, 40 aminoácidos, oligonucleótidos, nucleótidos, oligosacáridos, monosacáridos, fosfatos y iones en general. La invención propuesta tiene un diseño especial y diferente a los dispositivos desarrollados previamente. Se compone de dos cámaras interna y externa, respectivamente. La cámara externa se cierra herméticamente y se aisla de la cámara interna, al montar el sistema. La cámara externa posee una entrada y una salida de fluido, los cuales permiten 45 recolectar el material que pasa a través de la membrana semipermeable de la cámara interna hacia la externa. La cámara interna está compuesta de un dispositivo hueco, preferentemente de forma cilíndrica, con fondo plano y orificios en la pared lateral de la cámara interna, los cuales permitirán el filtrado, a través de la membrana permeable, de moléculas o iones hacia la cámara externa. La cámara interna está recubierta por una membrana semipermeable que 50 puede intercambiarse y que puede variar el tamaño de poro de acuerdo a las necesidades del usuario. Existe una tapa para la cavidad interna. El tapón posee orificios que conectan el exterior con la cavidad de la cámara interna. Dos de estos orificios permiten la entrada y salida del sistema de control de temperatura. En la parte inferior y superior del cilindro de la cámara interna cubierto con la membrana se coloca el sistema de sellado hermético que consiste en anillos que permiten mantener la membrana semipermeable sobre el cilindro de la cámara interna y que aísla al mismo tiempo la cámara interna de la cámara externa y evita la pérdida 5 de fluido y contaminación por fluídos en ambas cámaras. Una tapa inferior, con sistema de sujeción que permite la presión del anillo inferior para el sellado de la membrana y de las cámaras interna y externa. Asimismo el diseño incluye una tapa de la cámara externa, que permite presionar la tapa de la cámara interna y el anillo superior para mantener la membrana semipermeable sobre el cilindro por el cual se sella la cavidad interna y externa de forma 10 hermética. Para evitar la fricción, en el caso de que la tapa sea de rosca, se incluyen anillos con sistema de baleros para evitar la fricción de la tapa superior al momento del sellado. El montaje a detalle se explica en una sección posterior. Para el uso del dispositivo, se monta el sistema incluyendo en la cámara interna el material a probar (alimento, peletizado, comprimido, etc.) , se cierra la tapa superior de la cámara externa y a través de los orificios de la tapa de la 15 cámara interna, expuestos al exterior, se añaden las soluciones de trabajo. La temperatura de reacción se establece a través del sistema de recirculación o de transferencia de calor ajustado a la temperatura requerida para mantener la temperatura del fluido de la cámara interna a la temperatura deseada. La celdilla de digestión lixiviación se coloca sobre una parrilla de agitación magnética,...

1. La invención consiste en una celdilla de digestión-lixiviación con cerrado hermético y control de temperatura, que contiene:

Una celdilla (reactor) de digestión-lixiviación (dibujo B) cuyas partes incluyen (la numeración 5 entre paréntesis corresponde a las partes del dibujo B) .

Una cámara externa (1) caracterizada por su sellado hermético respecto a la cámara interna (2) , posee una entrada (10) y una salida (11) de fluido, las cuales permiten recolectar el material que pasa de la cavidad interna (1) a través de la membrana semipermeable (3) a la 10 cavidad externa (2) .

Una cámara interna caracterizada por ser un dispositivo rígido, hueco (2) , preferentemente de forma cilíndrica, con fondo plano, y orificios en la pared lateral de la cámara interna, los cuales permitirán el filtrado de moléculas o iones a través de la membrana (3) hacia la cámara externa 15 (1) .

Una membrana semipermeable (3) caracterizada porque puede variar el tamaño de poro desde 100 daltons a 100, 000 daltons o más, que cubre la pared externa del cilindro de la cámara interna (2) y que permite el paso de moléculas o iones de menor tamaño respecto al 20 poro de la membrana hacia la cavidad externa (1) .

Una tapa para la cavidad interna (4) , preferentemente rígida, caracterizada por que posee orificios de un mm o más de diámetro, que conectan el exterior con la cavidad y el fluido de la cámara interna (2) . Dos de estos orificios permiten la entrada y salida del sistema de control de 25 temperatura (5) . Los orificios permiten el tomar muestras o introducir dispositivos para la medición de parámetros ambientales y químicos dentro del reactor interno (cámara interna) como, temperatura, pH, salinidad, moléculas, iones, etc.

Un sistema de control de temperatura (5) caracterizado por la posibilidad de recirculación de 30 refrigerante (fluido a la temperatura deseada) o por ser un dispositivo o sistema generador de calor, para el ajuste de la temperatura del fluido en la cámara interna (2) .

Un sistema de sellado hermético con anillos (6) , preferentemente flexibles, que permiten mantener la membrana semipermeable (3) sobre el cilindro de la cámara interna (2) y que aísla 35 al mismo tiempo la cámara interna (2) de la cámara externa (1) y evita la pérdida de fluido en ambas cámaras (1 y 2) .

Una tapa inferior (7) , preferentemente rígida, caracterizada por tener un sistema de sujeción por tornillos u otro sistema de presión, que permita la presión del anillo (6) para el sellado de la 40 membrana (3) y de las cámaras interna (2) y externa (1 ) .

Una tapa (8) de la cámara externa (1 ) , preferentemente rígida, que genera presión al enroscarse, o por cualquier otro método de presión, que permite presionar el anillo (6) superior y mantener la membrana semipermeable (3) sobre el cilindro (2) por el cual se sella la cavidad 45 interna (2) y externa (1 ) .

Un anillo con sistema rotativo, caracterizado por ser un balero plano (9) para evitar la fricción de la tapa superior (8) al momento del cerrado y sellado.

Una entrada (10) de fluido, que permite controlar por su diámetro o sistema de cierre el paso de fluido hacia la cámara externa (1) .

Una salida (11) de fluido, que permite controlar por su diámetro o sistema de cierre el paso de fluido hacia afuera de la cámara externa (1) .

2. De acuerdo a la reivindicación 1 una celdilla y con todas o algunas de sus partes, en de cualquier dimensión de reactor (cm a metros) , volumen (mililitros a hectólitros) y tipo de 5 materiales (metálicos, plásticos, poliésteres, polietilenos, siliconas, baquelitas, acrílicos, biopolímeros, etc.) .