Caracterización de nucleobases.

Un método para caracterizar un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico,

comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

(a) poner en contacto un ácido nucleico con un oligómero de ácido peptidonucleico (APN) capaz de hibridar con una región del ácido nucleico y que carece de una base complementaria a la del nucleótido a caracterizar, para formar un dúplex de ácido nucleico/APN; y

(b) poner en contacto el dúplex de ácido nucleico/APN con una o más bases modificadas seleccionadas entre el grupo que consiste en:

Caracterización de nucleobases Campo técnico de la invención

La presente invención proporciona compuestos de nucleobases modificadas, compuestos miméticos de ácidos nucleicos modificados y varios usos de estos compuestos. Más específicamente, la invención proporciona métodos para la caracterización de nucleobases, la caracterización de SNP y la secuenciación de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Aunque ya se han publicado dos métodos originales para la secuenciación de ADN -el método químico de Maxim y Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, PNAS, 1977, 74, 56-564) y los métodos enzimáticos de Sanger (F. Sanger et al., PNAS, 1976, 5463-5467)- el método dominante que se usa actualmente se basa en la aproximación de Sanger y la llamada terminación o dideoxi-secuenciación. Esta metodología fundamental se basa en la terminación parcial de una hebra creciente de ADN, generándose una escalera de fragmentos marcados, que requieren una separación por tamaño para poder llevarse a cabo el análisis de la secuencia de ADN. Obviamente, se han introducido varias mejoras en el método desde su concepción inicial; así, los marcadores han evolucionado, sustituyéndose los nucleótidos radiactivos convencionales por compuestos fluorescentes, y ahora se usan capilares rellenos de polímero en vez de electroforesis en geles planos, para aplicaciones de secuenciación a gran escala. En consecuencia hoy en día se tiende al uso sistemático de aproximaciones masivas, tales como el uso simultáneo de 96 capilares o el uso de cuatro fluorocromos en un único canal, a la vez que las mejoras en la sensibilidad en la detección de fluorescencia y el uso de polimerasas más eficientes han ido permitiendo realizar secuenciaciones más largas. No obstante, el hecho de que este método tenga limitaciones inherentes se hace patente por el esfuerzo colosal que ha requerido la secuenciación del genoma humano. En los últimos años se han descrito varias aproximaciones nuevas que se pueden clasificar en tres categorías: (i) la secuenciación por la adición repetitiva de bases individuales; (ii) la pirosecuenciación y (iii) la ruptura mediada por enzimas de restricción o la ligación mediada por quinasas con desconvolución/descodificación.

(i) Secuenciación por adición repetitiva de bases individuales.- Se han publicado varios trabajos sobre este tema (Z.M. Li et al, PNAS, 23, 1, 414-419; T.S. Seo et al, PNAS, 5 25, 12, 5926-5931; L.R. Bi et al, J. Am. Chem. Soc., 26, 128, 2542). Este enfoque se basa en la adición mediada por un enzima de una única base a una hebra cebada de ADN. La adición de la base se controla mediante una modificación del grupo trifosfato que imposibilita la adición de más de una base al mismo tiempo. Por ejemplo, mediante un bloqueante físico en el nucleótido o mediante un bloqueante químico (por ejemplo, un grupo éster en el grupo 3OH). Este enfoque se basa en el uso de bloques marcados fluorescentemente, de manera que normalmente al eliminarse el bloqueante también se libera el fluoróforo, permitiéndose el comienzo de otro ciclo de reacción. Este enfoque tiene varios problemas; por ejemplo, este método necesita enzimas y complejos grupos que contienen trifosfato.

(ii) Pirosecuenciación (P. Nyren et.al, Anal. Biochem., 1996, 242, 84-89), En este enfoque una hebra creciente, cebadora de ADN se trata con una enzima y uno de los cuatro trifosfatos. Si la base se incorpora, el pirofosfato se libera; si no hay incorporación, entonces no se genera pirofosfato. El pirofosfato reacciona con una sulfurilasa, que lo transforma en ATP en presencia de APS (5-fosfosulfato de adenosina). Este compuesto se trata entonces con otra enzima (luciferasa) que produce luz. Esta luz se usa para determinar cuánta y si hay adición de una base específica a la hebra creciente de ADN. Si dos o más bases del mismo tipo se añaden en una sola vez, entonces se genera más luz, cuya intensidad puede cuantificarse. El proceso se repite con el siguiente tipo de trifosfato, generándose así secuencias. Hay un número de problemas con este enfoque, que incluyen el hecho de que la cuantificación de la emisión de luz no siempre es posible, de manera que es imposible leer secuencias largas que contengan la misma base (es decir, en la práctica es imposible distinguir entre 14 y 15 bases del mismo tipo debido a la variabilidad en la emisión de luz). Este es el método usado en un artículo reciente describiendo la secuenciación por el extremo 5 usando millones de microesferas organizadas en micromatrices (M. Margulies et al., Nature, 25, 437, 376-38).

(iii) Ruptura mediada por enzima de restricción o ligación con deconvolución/decodificación (S. Brenner et ai, Nature Biotech., 2, 18, 63-634).- En este enfoque, las secuencias se cortan usando una enzima de restricción para producir una secuencia colgante. Estas secuencias se decodifican usando una serie de 16 adaptadores codificados. Los adaptadores son a su vez cortados, lo que expone el siguiente bloque de bases a otro ciclo de decodificación. Un resultado semejante puede conseguirse mediante ligación. De nuevo, hay una serie de problemas: se necesitan varios pasos porcada deconvolución; se sigue necesitando sondas marcadas y diversas enzimas; hay cortes incompletos o no deseados, etc. Este fue el método usado por Brenner (S. Brenner et al, Nature Biotech., 2, 18, 63-634) y por Shendure y Church en su método de secuenciación masiva en paralelo usando chips (microesferas atrapadas en un gel de poliacrilamida, J. Shendure et.al., Science, 25, 38, 1728-1732 and R. D. Mitra et al., PNAS, 23, 1, 5926-5931).

Polimorfismos de nucleótido simple: Otro área, pero relacionada con la secuenciación es la de los polimorfismos de nucleótido único (A-C. Syvanen et al, Nature Genetics, 25, 37, S5-S1). En realidad el análisis de SNP puede concebirse como si fuera la secuenciación de una única base. En humanos, existe por término medio un SNP por cada 3-1. bases, y representan hasta un 9 % de la variabilidad genética entre individuos. Un SNP puede constituir un factor de riesgo (o también una ventaja) respecto a enfermedades determinadas y también un determinante de características físicas. Hay muchos y variados métodos para analizar los SNP, pero generalmente consisten en reacciones de extensión de cebadores usando polimerasas y trifosfatos marcados fluorescentemente, aunque los métodos de captura y de análisis varían considerablemente. El análisis de los SNP es una forma sencilla de secuenciación de ADN en algunos aspectos, en el sentido de que determinar la identidad de una única base es el objetivo principal (aunque su contexto es, por supuesto, crucial).

Ligaciones y reacciones dirigidas por ADN. El ADN y los ácidos peptidonucleicos (APN) se han usado para síntesis de compuestos en diversas aproximaciones químicas basadas en ligación (véase sobre todo el trabajo de D. R. Liu and O. Seitz -X. Li y D.R. Liu, Angew. Chem. Int. Ed., 24, 43, 4848-487; S. Ficht et al, ChemBioChem, 25, 6, 298-213). La ligación no enzimática también se ha usado en el sentido ADN-ADN por Kool y Richert (N. Griesang et al, Angew. Chem. Int. Ed., 26, 45, 6144-6148 y referencias incluidas, por ejemplo P. Hagenbuch et al, Angew. Chem. Int. Ed. 25, 44, 6588-6592), quienes usaron química clásica de adición de nucleófilos para ligar hebras de ADN (reaccionando el 3-fosfotioato con una 5-yodotimidina) o monómeros (reaccionando, por ejemplo, el 3- aminonucleótido con un fosfato activado). El primer enfoque se pudo utilizar para la detección mediante color de mutaciones puntuales en ARN y ADN, aunque ello requiere cebadores largos tanto en el nucleófilo como en el electrófilo. El método de Richerts, aunque se basa en monómeros, requería los llamados cebadores de ayuda de forma que la incorporación directa requería dos cebadores que abarcasen la base. Liu usó química dinámica para componer polímeros de APN utilizando un molde de ADN (D.R. Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 23, 125, 13924- 13925).

Los APN se han usado previamente como sondas genéticas (véase la revisión de P. Pauiosova y F. Pellestor Ann. Genetique, 24, 47, 349-358) debido a su capacidad de reconocer con mucha precisión secuencias complementarias de ADN o de ARN; no obstante, como no pueden ser reconocidos por polimerasas su uso como herramienta de análisis genético ha sido muy limitado.

Química dinámica: Durante la pasada década ha habido una intensa actividad en el área de las bibliotecas dinámicas (combinatorias) (P. T. Corbett et al. Chem. Rev., 26, 16, 3652-3711; J.M. Lehn, Chem. Eur. J, 1999, 5, 2455-2463, O. Ramstrom and J.M. Lehn, Nat. Rev. Drug Discov., ,22 1, 26-36). Una biblioteca dinámica se puede preparar mezclando en solución dos compuestos complementarios, como una selección... [Seguir leyendo]

1. Un método para caracterizar un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

(a) poner en contacto un ácido nucleico con un oligómero de ácido peptidonucleico (APN) capaz de hibridar con una región del ácido nucleico y que carece de una base complementaria a la del nucleótido a caracterizar, para

formar un dúplex de ácido nucleico/APN; y , ,..... , x

(b) poner en contacto el dúplex de ácido nucleico/APN con una o mas bases modificadas seleccionadas entre el

grupo que consiste en:

en donde Y es un grupo funcional capaz de llevar a cabo reacciones covalentes reversibles; X^es un marcador detectable, combinaciones de espaciador y marcador o hidrogeno; y Z es carbono o nitrógeno;

en donde el oligómero de APN incluye un grupo capaz de reaccionar reversiblemente con el grupo funcional Y, y en donde la base modificada que se integra con el dúplex de ácido nucleico/APN es complementaria a la del nucleótido a caracterizar, caracterizándose el nucleótido mediante espectrometría de masas o mediante el marcador detectable de la base modificada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que Y se selecciona entre el grupo que consiste en aldehidos, cetonas, tioles y/o dioles.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el método de caracterización de un nucleótido se usa para caracterizar polimorfismos de nucleótido simple.

4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el método de caracterización de un nucleótido se usa para

secuenciar ácidos nucleicos.

5. El método de las reivindicaciones 1-3, en el que el marcador detectable se identifica mediante espectrometría de masas o métodos de microscopía.

6. El método de las reivindicaciones 1 -5, en el que el ácido nucleico y/o el APN se inmovilizan sobre o se unen de otro modo a un sustrato de soporte.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico y/o el APN se inmovilizan o se unen como una matriz o micromatriz.

8. Una base modificada seleccionada entre el grupo que consiste en.

(¡)

H

(¡i)

(iii)

O

N

y

nh2

Y

en las que Y es un grupo funcional capaz de producir reacciones covalentes reversibles seleccionado entre el 5 grupo que comprende (i) un aldehido; y (¡I) una cetona;

X1-X4 es hidrógeno o comprende un marcador detectable seleccionado entre el grupo que consiste en: (I) uno o más seleccionados entre el grupo que comprende dansilo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, IAEDANS, pigmentos de clanlna (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), pigmentos Bodipy (Invitrogen), pigmentos Alexa Fluor (Invitrogen) y pigmentos SNARF; y (¡I) un marcador masa;

Z es carbono o nitrógeno;

con la condición de que X1 no sea Br.

9. El uso de una o más bases/nucleobases modificadas seleccionadas entre el grupo que consiste en:

(I)

(¡O

(iii)

O

y

NH2

Y

en las que Y es un grupo funcional capaz de llevar a cabo reacciones covalentes reversibles seleccionado entre el grupo que consiste en (i) aldehido; y (ii) cetona; X1-X4 es hidrógeno o comprende un marcador detectable 5 seleccionado entre el grupo que consiste en (i) uno o más seleccionados entre el grupo que consiste en dansilo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, IAEDANS, pigmentos de cianina (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), pigmentos Bodipy (Invltrogen), pigmentos Alexa Fluor (Invitrogen) y pigmentos SNARF; y (ii) un marcador de masa; y Z es carbono o nitrógeno; en métodos de análisis genético.

1. El uso de la reivindicación 9, en el que los métodos de análisis genético incluyen la caracterización e identificación de nucleobases de ácidos nucleicos con el propósito de caracterizar polimorfismos de un único nucleótldo y/o secuenciar ácidos nucleicos.

11. Un kit que proporciona reactivos y compuestos útiles en métodos para la caracterización de un nucleótido de un

ácido nucleico y/o para secuenciar un ácido nucleico, comprendiendo dicho juego componentes seleccionados entre el grupo que consiste en:

(a) un ollgómero de ácido peptldonuclelco (APN) capaz de hlbridar con una región de un ácido nucleico que 2 carece de una nucleobase complementarla a aquella del nucleótldo a caracterizar,

(b) nucleobases modificadas seleccionadas entre el grupo que consiste en.

(i)

(¡i)

y

(iv)

en las que Y es un grupo funcional capaz de llevar a cabo reacciones covalentes reversibles seleccionado entre el grupo que comprende (i) un aldehído y (ii) una cetona;

X1-X4 es hidrogeno o comprende un marcador detectable seleccionado entre el grupo que consiste en (i) uno

o más seleccionados entre el grupo que consiste en dansilo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, IAEDANS, pigmentos de cianina (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), pigmentos Bodipy (Invitrogen), pigmentos Alexa Fluor (Invitrogen) y pigmentos SNARF; y (ii) un marcador de masa; y Z es carbono o nitrógeno; y 15 (c) instrucciones de uso.