Biomarcadores, métodos y kits para el diagnóstico de artritis reumatoide.

Un método in vitro para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto,

comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y

detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

donde la detección del complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

Biomarcadores, métodos y kits para el diagnóstico de artritis reumatoide

Sector de la técnica La presente invención reivindica la prioridad a la Solicitud de Patente Europea Nº EP 09 305 266 presentada el 30 de marzo de 2009 y la Solicitud de Patente Europea Nº EP 09 306 063.0 presentada el 6 de noviembre de 2009.

Estado de la técnica La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune crónica que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial. Se caracteriza por inflamación y proliferación celular en la cápsula sinovial de las articulaciones que en último término puede dar lugar a destrucción del cartílago y hueso, deformidad articular y pérdida de movilidad. La AR causa habitualmente problemas en varias articulaciones al mismo tiempo, a menudo de manera simétrica. La AR tiende precozmente a afectar primero las articulaciones pequeñas, tales como las articulaciones de las muñecas, manos, tobillos y pies. Según progresa la enfermedad, también pueden estar implicadas las articulaciones de los hombros, codos, rodillas, caderas, mandíbula y cuello. A diferencia de otras afecciones artríticas que solo afectan áreas en o alrededor de las articulaciones, la AR es una enfermedad sistémica que produce inflamación en tejidos extra-articulares por todo el cuerpo incluyendo la piel, vasos sanguíneos, corazón, pulmones y músculos.

La AR se asocia con dolor, deformidad, descenso de la calidad de vida, y discapacidad que afecta a su vez a la capacidad de los pacientes para llevar una vida normal y productiva. Estudios recientes han demostrado que 5 años después de la aparición de la enfermedad, aproximadamente un tercio de los pacientes con AR no son capaces de trabajar, y a los 10 años, la mitad de los pacientes tienen una discapacidad funcional importante (A. Young y col., Rheumatology, 2007, 46: 350-357) . En consecuencia, la AR impone una carga importante a la sociedad. Muchos datos también sugieren que la AR se asocia con una disminución en la esperanza de vida.

Aunque la AR se ha estudiado extensamente, la etiología y patogénesis de la enfermedad sigue sin comprenderse completamente. Los factores que pueden aumentar el riesgo de AR incluyen: el sexo del individuo (las mujeres tienen 2 o 3 veces más probabilidad que los hombres de desarrollar la enfermedad) ; la edad (la AR se produce más comúnmente entre las edades de 40 y 60 años, aunque puede atacar a niños, adolescentes y adultos más ancianos) ; la genética (la AR se encuentra fuertemente asociada con el antígeno HLA-DR4 del tejido heredado tipo complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) - más específicamente DRB1*0401 y DRB 1*0404) ; y el tabaquismo (la AR es aproximadamente 4 veces más común en fumadores que en no fumadores) .

Actualmente no existe una cura fiable para la AR. El tratamiento se dirige esencialmente a aliviar el dolor, reducir la inflamación y detener o ralentizar el daño articular y la destrucción ósea. La estrategia terapéutica actual es la prescripción de fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) precozmente en la afección, debido a que los pacientes que se tratan pronto con tales fármacos tienen mejores resultados, con mayor preservación de la función, menos incapacidad laboral, y menor riesgo de muerte prematura. Los avances recientes en el entendimiento de la patofisiología de la AR han dado lugar al desarrollo de nuevos DMARD, llamados modificadores biológicos de la respuesta. Los DMARD biológicos se diseñan para dirigirse y bloquear la acción de 45 ciertas células clave o moléculas, tales como el factor alfa de necrosis tumoral (TFN-α) , interleucina-1 (IL-1) , células T, y células B, implicadas en la reacción inmunitaria anormal que se asocia con la AR. En comparación con los DMARD tradicionales, los agentes biológicos tienen un inicio de acción mucho más rápido y pueden ofrecer una respuesta clínica mejor con una prevención a largo plazo del daño articular (J.K.D. de Vries-Bouwstra y col., Rheum. Dis. Clin. North Am., 2005, 31: 745-762) .

Debido a que la destrucción articular irreversible se puede evitar por la intervención en estadios tempranos de la enfermedad, es importante el diagnóstico precoz de la AR. Sin embargo, el diagnóstico definitivo de AR puede ser difícil. Los ensayos inmunológicos que se pueden llevar a cabo para el diagnóstico de AR incluyen, en particular, la medición de los niveles del factor reumatoide (RF) , y anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP) . El

ensayo serológico de RF es complicado debido a su sensibilidad y especificidad moderadas, y a las altas tasas de positividad en otras enfermedades inflamatorias crónicas e infecciosas (T. Dorner y col., Curr. Opin. Rheumatol, 2004, 16: 246-253) . El ensayo de anticuerpos anti-CCP es particularmente útil en el diagnóstico de AR, con alta especificidad, positividad precoz en el proceso de la enfermedad, y capacidad para identificar pacientes que probablemente tengan enfermedad grave y daño irreversible. Sin embargo, un resultado negativo en el ensayo de anticuerpos anti-CCP no excluye la AR.

El documento de AUGER I Y COL. () identificó la PAD4 y BRAF como autoantígenos específicos de la AR, por exploración con 8.268 matrices proteicas en sueros de pacientes con AR. Sin embargo, AUGER Y COL: () , los documentos de MICHELLE Y COL. (07-2008) y ZHAO JINXIA Y COL (06-2008) , cada documento 65 por separado, desvela los inmunoensayos para el diagnóstico de artritis reumatoides (AR) en un sujeto, que comprende la detección de al menos un biomarcador, tal como por ejemplo, péptidos de PAD4, pero no desvelan

BRAF y/o péptidos de BRAF. El documento WO 2004/020595 desvela métodos para diagnosticar un gran número de afecciones tales como por ejemplo la AR, midiendo el nivel de ciertos biomarcadores polinucleótidos y/o polipéptidos. El péptido de sec. 382 (169 aminoácidos) comprende una región que es idéntica al 100% con la SEC ID Nº 9 (20 aminoácidos) de la presente solicitud.

Por lo tanto, hay una gran necesidad de nuevos marcadores biológicos de AR. En particular, son altamente deseables, biomarcadores que permitieran un diagnóstico fiable y el seguimiento en estados precoces de la enfermedad y que permitan la intervención precoz para prevenir potencialmente el dolor, la destrucción articular y la incapacidad a largo plazo.

Objeto de la invención La presente invención se refiere en general a la mejora de los sistemas y estrategias de diagnóstico de artritis reumatoide (AR) . En particular, la invención se refiere a biomarcadores peptídicos que reaccionan específicamente con anticuerpos presentes en el suero de pacientes con AR. Más específicamente, la presente invención concierne a secuencias de aminoácidos de la PAD4, BRAF y calpastatina humanas, y métodos para utilizar tales secuencias en el diagnóstico de AR, en particular en el diagnóstico de AR en pacientes negativos al CCP.

Realizaciones de la invención:

1. Un método in vitro para el diagnóstico de la artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto la muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde al menos un biomarcador es el péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y detectar el complejo biomarcador anticuerpo formado, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

2. El método in vitro de la realización 1, comprendiendo además dicho método las etapas de: poner en contacto un muestra biológica obtenida del sujeto con al menos otro biomarcador durante un tiempo y en condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde al menos el otro biomarcador se selecciona del grupo constituido por: péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden o consisten en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC

ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden o consisten en una secuencia que se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y cualquier combinación de las mismas, y detectando cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se forme, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:

poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

donde la detección del complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

2. El método in vitro de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método además las etapas de:

poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos otro biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos otro biomarcador se selecciona de entre el grupo que consiste en:

péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos; y

detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

3. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos otro biomarcador es un péptido de menos de 50 aminoácidos.

4. El método in vitro de la reivindicación 2, donde dicho método se lleva a cabo con tres péptidos de BRAF, tres

péptidos de PAD4, y dos péptidos de calpastatina y donde los tres péptidos de BRAF consisten en las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº 9, los tres péptidos de PAD4 consisten en las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, y los dos péptidos de calpastatina consisten en las SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 12.

5. Un método in vitro para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

poner en contacto la muestra biológica con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una 45 secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

donde la detección de un complejo péptido de BRAF- anticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en la muestra biológica.

6. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el sujeto es negativo al CCP o la muestra biológica se obtiene de un sujeto negativo al CCP.

7. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además la medición, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, de la concentración de al menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste en proteína C-reactiva, amiloide A sérica, interleucina 6, proteínas S100, osteopontina, factor reumatoide, metaloproteasa de la matriz 1, metaloproteasa de la matriz 3, ácido hialurónico, sCD14, marcadores de angiogénesis, y productos del metabolismo del hueso, cartílago o sinovia.

8. Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho kit:

al menos un biomarcador, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el 65 grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y

al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

9. El kit de la reivindicación 8 que comprende además al menos otro biomarcador, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo constituido por:

péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y péptidos de calpastatina que tienen una secuencia e aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos, y

al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el al menos otro biomarcador y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

10. Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicho kit:

al menos ocho biomarcadores que comprenden:

tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y dos péptidos de calpastatina seleccionados de entre el grupo constituido por los péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas, y

al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el biomarcador y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto negativo al CCP.

11. Un kit para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:

al menos un biomarcador, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el

grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica, donde el autoanticuerpo es un autoanticuerpo anti-BRAF que es indicativo de artritis reumatoide.

12. Una matriz para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicha matriz al menos un biomarcador fijado en su superficie, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de 55 las mismas.

13. La matriz de la reivindicación 12 que comprende además al menos otro biomarcador fijado en su superficie, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo constituido por:

péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y

combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos.

14. Una matriz para el diagnóstico de artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicha matriz al menos ocho biomarcadores fijados en su superficie, donde los al menos ocho biomarcadores comprenden:

tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y dos péptidos de calpastatina seleccionados de entre el grupo que consiste en los péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas.

15. La matriz de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 que comprende además al menos un biomarcador adicional fijado en su superficie, para detectar la presencia de autoanticuerpos específicos de AR en una muestra biológica, preferentemente anticuerpos antinucleares y anticuerpos anti CCP.

16. Un biomarcador de artritis reumatoide, donde el biomarcador es:

Un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID 25 Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y donde el biomarcador es reconocido por un autoanticuerpo anti-BRAF.

17. Un kit de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 o una matriz de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, donde los péptidos de PAD4 y los péptidos de calpastatina son péptidos de menos de 50 30 aminoácidos.