Asparaginasas termoestables.

Método para preparar un polipéptido que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de aminoácidos de un polipéptido original que tiene actividad de asparaginasa;

(b) seleccionar al menos un residuo de aminoácido en una posición de la secuencia que corresponda a cualquiera de las posiciones 54, 57, 70, 83, 84, 86, 102, 137, 164, 196, 201, 228, 260, 262, 278, 283, 290, 307, 312, 323, 327, 334, 336, 337, 349, 351, 353, 366 y/o 375 en SEC ID nº: 1;

(c) modificar la secuencia por substitución del residuo de aminoácido seleccionado;

(d) producir una variante de polipéptido que tenga la secuencia modificada;

(e) probar la variante de polipéptido para actividad de asparaginasa y termotolerancia; y

(f) seleccionar una variante de polipéptido con actividad de asparaginasa y termotolerancia más alta en comparación con el polipéptido original.

Asparaginasas termoestables Campo de la invención [0001] La invención se refiere a nuevas asparaginasas que tienen propiedades mejoradas, preferiblemente termotolerancia mejorada, tal como actividad mejorada a altas temperaturas y/o termoestabilidad mejorada. La invención también se refiere a las secuencias de ADN que codifican tales asparaginasas mejoradas, su producción en una célula huésped recombinante, al igual que métodos del uso de las asparaginasas, en particular para reducir la acrilamida en alimentos. La invención además se refiere a métodos para generar y preparar variantes de asparaginasa que tengan propiedades mejoradas.

Antecedentes de la invención [0002] Se sabe que la acrilamida se forma en diferentes materiales alimenticios durante el calentamiento a altas temperaturas. La formación de acrilamida se ha asignado a una reacción de Maillard donde la asparagina es uno de los reactivos. Se sabe bien que la formación de acrilamida en productos alimenticios calentados se puede reducir mediante un tratamiento que reduce la cantidad de asparagina en los materiales alimenticios, tal como sometiendo los materiales alimenticios a la acción de la enzima asparaginasa (véase, por ejemplo, la WO2004/026042 (Frito-Lay North America, Inc.) ) .

Varias asparaginasas microbianas se han identificado, véase, por ejemplo, la WO2004/030468 (DSM) , que revela la secuencia de una asparaginasa derivada de Aspergillus niger, o la WO2004/032648 (Novozymes A/S) que divulga secuencias de asparaginasas derivadas de Aspergillus or y zae y Penicillium citrinum. La WO2004/032648 también menciona las secuencias de aminoácidos de asparaginasas de Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans. La secuencia de aminoácidos de una asparaginasa de Aspergillus terreus se puede obtener de la base de datos UniProt (número de entrada: q0cwj1) .

La secuencia de aminoácidos y la estructura cristalina de una L-asparaginasa de Erwinia chr y santhemi se han descrito (Jacek Lubkowski, Miroslawa Dauter, Khosrow Aghaiypour, Alexander Wlodawera and Zbigniew Dauter (2003) Atomic resolution structure of Erwinia chr y santhemi L-asparaginase. Acta Cr y st. D, 59, 84-92) .

Un método para diseñar proteínas con termoestabilidad mejorada utilizando 3-isopropilmalato deshidrogenasa de Thermus thermophilus como enzima modelo se ha descrito (Watanabe, K. et al. (2006) J. Mol. Biol. 355, 664- 674) .

La EP-A-1704782 divulga un proceso para la producción de un producto alimenticio que implica al menos un paso de calentamiento, que comprende la adición de una o varias enzimas a una forma intermedia de dicho producto alimenticio en dicho proceso de producción, por lo cual la enzima se añade antes de dicho paso de calentamiento en una cantidad que es eficaz para reducir el nivel de aminoácidos que están presentes en dicha forma intermedia de dicho producto alimenticio cuyos aminoácidos están implicados en la formación de acrilamida durante dicho paso de calentamiento. Una asparaginasa de Aspergillus niger está descrita.

Para algunas aplicaciones, las asparaginasas que tienen propiedades mejoradas se prefieren, tales como las asparaginasas que tienen termotolerancia mejorada, por ejemplo, termoestabilidad mejorada o actividad mejorada a altas temperaturas.

Es un objeto de la presente invención proporcionar asparaginasas alternativas, en particular asparaginasas nuevas que tengan propiedades mejoradas. Tales asparaginasas mejoradas son adecuadas para su uso, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios.

Resumen de la invención [0009] Los presentes inventores han modelado la estructura tridimensional de una asparaginasa de Aspergillus or y zae basada en la estructura publicada de una enzima homóloga de Erwinia chr y santhemi. Basándose en la estructura modelada, los inventores han identificado residuos de aminoácidos importantes para mejorar las propiedades de la asparaginasa, especialmente la termotolerancia.

Además, los presentes inventores han predicho una secuencia de asparaginasa ancestral inferida y a partir de esta secuencia han identificado otros residuos de aminoácidos importantes para mejorar las propiedades de una asparaginasa, especialmente la termotolerancia.

Basándose en tales consideraciones funcionales y estructurales, se construyeron variantes de asparaginasa que tenían residuos de aminoácidos modificados en las posiciones identificadas y que tenían propiedades fisicoquímicas alteradas, actividad relativa especialmente mejorada a altas temperaturas y/o termoestabilidad mejorada.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para preparar un polipéptido que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de aminoácidos de un polipéptido original que tenga actividad de asparaginasa;

(b) seleccionar al menos un residuo de aminoácidos en una posición en la secuencia que se corresponda con cualquiera de las posiciones: 54, 57, 70, 83, 84, 86, 102, 137, 164, 196, 201, 228, 260, 262, 278, 283, 290, 307, 312, 323, 327, 334, 336, 337, 349, 351, 353, 366 y/o 375 de SEC ID nº : 1;

(c) modificar la secuencia por substitución del residuo de aminoácido seleccionado;

(d) producir un polipéptido variante que tenga la secuencia modificada;

(e) probar el polipéptido variante para actividad de asparaginasa y termotolerancia; y

(f) seleccionar un polipéptido variante que tenga actividad de asparaginasa y termotolerancia más altas en comparación con el polipéptido original.

La invención también se refiere a asparaginasas termotolerantes, que se pueden obtener mediante tal método. [0014] Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa;

(b) tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 196I, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 351A, 366P y/o 375T, donde cada posición corresponde a una posición de los aminoácidos 1 a 378 de SEC ID nº : 1; y

(d) muestra una actividad de asparaginasa residual después de tratamiento térmico de al menos 50% de la actividad de asparaginasa sin tratamiento térmico, donde el tratamiento térmico es incubación con pH 6 a una temperatura de al menos 64º C durante 20 minutos.

La presente invención también se refiere a un polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa;

(b) tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos de 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 1961, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 351A, 366P y/o 375T, donde cada posición corresponde a una posición de los aminoácidos 1 a 378 de SEC ID nº : 1; y

(c) muestra una actividad de asparaginasa a pH 6 que es al menos un 25% más alta a 65º C que a 37º C.

En otros aspectos, la invención se refiere a asparaginasas nuevas que comprenden diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con la SEC ID nº : 1 en posiciones identificadas como importantes para mejorar la termotolerancia de la enzima.

Por consiguiente, la presente invención en un aspecto se refiere a un polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa;

(b) tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende una sustitución en una posición que se corresponde con cualquiera de las posiciones 54, 57, 70, 83, 84, 86, 102, 137, 164, 196, 201, 228, 260, 262, 278, 283, 290, 307, 312, 323, 327, 334, 336, 337, 349, 351, 353, 366 y/o 375 en SEC ID nº : 1; y

(d) muestra una actividad de asparaginasa residual después de tratamiento térmico de al menos 50% de la asparaginasa sin tratamiento térmico, donde el tratamiento térmico es incubación con pH 6 a una temperatura de al menos 64º C durante 20 minutos.

Las diferencias de los aminoácidos se pueden obtener modificando una secuencia original, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio. No obstante, también se pueden encontrar en polipéptidos de origen natural, que nacen con tales diferencias de aminoácidos en comparación con la SEC ID nº : 1.

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican las asparaginasas y a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, al igual que métodos para producir y utilizar las asparaginasas.

Breve descripción... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar un polipéptido que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de aminoácidos de un polipéptido original que tiene actividad de asparaginasa;

(b) seleccionar al menos un residuo de aminoácido en una posición de la secuencia que corresponda a cualquiera de las posiciones 54, 57, 70, 83, 84, 86, 102, 137, 164, 196, 201, 228, 260, 262, 278, 283, 290, 307, 312, 323, 327, 334, 336, 337, 349, 351, 353, 366 y/o 375 en SEC ID nº : 1;

(c) modificar la secuencia por substitución del residuo de aminoácido seleccionado; 10 (d) producir una variante de polipéptido que tenga la secuencia modificada;

(e) probar la variante de polipéptido para actividad de asparaginasa y termotolerancia; y

(f) seleccionar una variante de polipéptido con actividad de asparaginasa y termotolerancia más alta en comparación con el polipéptido original.

2.Método según la reivindicación 1, donde la secuencia del polipéptido original tiene al menos 50% de identidad con los aminoácido.

8. 378 de SEC ID nº : 1, los aminoácido.

8. 378 de SEC ID nº : 2, los aminoácido.

8. 374 de SEC ID nº : 3, los aminoácido.

8. 378 de SEC ID nº : 4, los aminoácido.

8. 379 de SEC ID nº : 5 o los aminoácido.

8. 375 de SEC ID nº : 6.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la termotolerancia más alta comprende una actividad de asparaginasa más alta tras la incubación con pH 6 a una temperatura de al menos 64º C durante 20 minutos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la termotolerancia más alta comprende una actividad de asparaginasa relativa más alta con pH 6 a 65º C en comparación con 37º C. 25

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la secuencia es modificada por al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K/S, 83V, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 1961, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 349Q, 351A, 353I, 366P y/o 375T, donde cada posición corresponde a una posición de los aminoácidos 1 a 378 de SEC ID nº : 1.

6. Polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa;

(b) tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 1961, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 351A, 366P y/o 375T, donde cada posición corresponde a una posición de los aminoácidos 1 a 378 de SEC ID nº : 1; y

(d) muestra una actividad de asparaginasa residual después del tratamiento térmico de al menos 50% de la actividad de asparaginasa sin tratamiento térmico, donde el tratamiento térmico es incubación con pH 6 a una 40 temperatura de al menos 64º C durante 20 minutos.

7. Polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa; 45 (b) tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 196I, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 351A, 366P y/o 375T, donde cada posición corresponde a una posición de los aminoácidos 1 a 378 de SEC ID nº : 1; y

(d) muestra una actividad de asparaginasa a pH 6 que es al menos 25% más alta a 65º C que a 37º C. 50

8. Polipéptido que:

(a) tiene actividad de asparaginasa;

(b) tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 80 a 378 de SEC ID nº : 1;

(c) comprende una sustitución en una posición que corresponde a cualquiera de las posiciones 54, 57, 70, 83, 84, 86, 102, 137, 164, 196, 201, 228, 260, 262, 278, 283, 290, 307, 312, 323, 327, 334, 336, 337, 349, 351, 353, 366 y/o 375 en SEC ID nº : 1; y

(d) muestra una actividad de asparaginasa residual después del tratamiento térmico de al menos 50% de la actividad de asparaginasa sin tratamiento térmico, donde el tratamiento térmico es incubación con pH 6 a una 60 temperatura de al menos 64º C durante 20 minutos.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K/S, 83V, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 196I, 201 Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 349Q, 351A, 353I, 366P y/o 375T.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: 54I, 57L, 70H/K, 84D, 86P, 102D, 137S, 164D, 196I, 201Q, 228V, 260K, 262D, 278H/Q, 283C, 290V, 307A, 312Y, 323R, 327V, 334F, 336C/G/L, 337F/I, 351A, 366P y/o 375T.

11. Polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que comprende una de las siguientes sustituciones: N70H o N70K.

12. Polipéptido según la reivindicación 11, que comprende la sustitución N70K.

13. Polipéptido según la reivindicación 12, que comprende además al menos una de las siguientes sustituciones: 323R, 327V, 349Q, 351A y/o 353I.

14. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13. 15

15. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 14 operativamente enlazada a una o varias secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

16. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 15 y/o un vector de expresión que comprende tal constructo de ácidos nucleicos.

17. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, el método comprende:

(a) cultivo de la célula huésped según la reivindicación 16 para producir un sobrenadante que incluya el polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

18. Método para producir un producto alimenticio, que comprende: 30

(a) facilitar un material alimenticio; y

(b) tratar el material alimenticio con el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.

Archivo de parámetro para Simulación de Dinámica Molecular

em.mdp

; VARIAS OPCIONES DE PROCESAMIENTO = título = cpp = /lib/cpp incluye = define = -DEFLEXIBLE

; PARÃ?METROS DE CONTROL DE EJECUCIÓN = integrador = pendiente ; tiempo de inicio y paso de tiempo en ps = tinit =0 dt =0, 001 nsteps =100

; OPCIONES DE MINIMIZACIÓN DE ENERGÃ?A = emto1 =0, 00001 emstep =0, 1 nstcgsteep = 1000

Figura 4

Archivo de parámetro para Simulación de Dinámica Molecular

md.mdp

título = asparaginasa cpp = /lib/cpp restricciones = todos los enlaces integrador = md dt = 0, 002; ps ! nsteps = 5000; total 5 ps. nstcomm = 1 nstxout = 50 nstvout = 0 nstfout = 0 nstlist = 10 ns_type = rejilla rlist = 1, 0 rcoulomb = 1, 0 rvdw = 1, 0 ; Acoplamiento de temperatura de Berendsen está activo en dos grupos Tcoupl = berendsen tau_t = 0, 1 0, 1 tc-grps = proteína sol ref_t = 300 300 ; Acoplamiento de presión no está activo Pcoupl = no tau_p = 0, 5 compresibilidad =4, 5e-5 ref_p = 1, 0 ; Velocidades generadas está activo a 300 K. gen_vel = sí gen_temp = 300, 0 gen_seed = 173529

Figura 5