Anticuerpos monoclonales anti-claudina 1 para la inhibición de la infección por virus de la hepatitis C.

Una línea celular de hibridoma depositada en el DSMZ el 29 de julio de 2008 con el número de acceso seleccionado del grupo que consiste en DSM ACC2931,

DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937, y DSM ACC2938.

Anticuerpos monoclonales anti-claudina 1 para la inhibición de la infección por virus de la hepatitis C

Solicitudes relacionadas 5

La presente solicitud reivindica prioridad sobre la Solicitud de Patente Europea Nº EP 08 305 597.0 registrada el 25 de septiembre de 2008.

Estado de la técnica 10

El virus de la hepatitis C (VHC) es un gran problema de salud mundial, con una estimación de 150-200 millones de personas infectadas por todo el mundo, incluyendo al menos 5 millones de individuos infectados en la Unión Europea (Pawlotsky, 2004) . De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, suceden de 3 a 4 millones de nuevas infecciones cada año. A menudo la infección es asintomática, sin embargo, la mayoría de individuos infectados por 15 VHC desarrollan infección crónica (Hoofnagle, 2002; Lauer, 2001; y Seeff, 1995) . La infección crónica por VHC da como resultado frecuentemente en enfermedad hepática grave, incluyendo fibrosis y esteatosis (Chisari, 2005) . Aproximadamente el 20 % de los pacientes con infección crónica por VHC desarrollan cirrosis hepática, que progresa a carcinoma hepatocelular en el 5 % de los casos (Hoofnagle, 2002) .

La infección crónica por VHC es la principal indicación para trasplantes hepáticos (Seeff, 2002) . Desafortunadamente, el trasplante de hígado no es una cura para la hepatitis C; la recurrencia viral es un problema invariable y una causa principal de pérdida del injerto (Brown, 2005) . No hay vacunas disponibles que protejan frente al VHC. Las terapias actuales incluyen la administración de ribavirina y/o interferón alfa (IFN-α) , dos agentes antivirales no específicos. Usando un tratamiento combinado de IFN-α pegilado y ribavirina, se logra una eliminación persistente en 25 aproximadamente el 50 % de los pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo, un gran número de pacientes tiene contraindicaciones para uno de los componentes de la combinación, no pueden tolerar el tratamiento, no responden a la terapia con IFN o experimentan una recidiva cuando se interrumpe la administración. Además de la eficacia limitada y los efectos secundarios sustanciales, tales como neutropenia, anemia hemolítica y depresión grave, las terapias antivirales actuales también se caracterizan por un elevado coste. 30

Hasta hace poco, el desarrollo de agentes terapéuticos más efectivos para combatir la infección por VHC se había visto impedido por la carencia de un sistema de cultivo celular que soportase la replicación de VHC. La producción robusta de VHC infeccioso en cultivo celular se ha logrado recientemente usando un genoma de VHC único derivado de la sangre de un paciente japonés con hepatitis C fulminante (JFH-1) (Wakita, 2005; Lindenbach, 2005; Zhong, 35 2005) . La capacidad de la cepa JFH-1 de VHC para liberar partículas infecciosas en cultivo celular (VHCcc) y el desarrollo de seudopartículas de VHC retrovirales (VHCpp) (Bartosch, 2003; Hsu, 2003) ha permitido estudios acerca del mecanismo de la entrada y replicación del VHC que han conducido a la identificación de biomoléculas diana terapéuticas potenciales.

El VHC es un virus de hebra de ARN positiva clasificado en el género Hepacivirus, dentro de la familia Flaviviridae. La traducción del principal marco abierto de lectura del genoma de VHC da como resultado la producción de una poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos de longitud, que se escinde co- y pos-traduccionalmente mediante la acción coordinada de proteasas celulares y virales en al menos 10 proteínas maduras, incluyendo dos glucoproteínas de envuelta (E1 y E2) . El VHC inicia la infección uniéndose a moléculas o receptores en la superficie de 45 los hepatocitos. Las pruebas actuales sugieren que al menos cuatro moléculas de la célula hospedadora son importantes para la entrada del VHC in vitro: la tetraspanina CD81 (Pileri, 1998) , el receptor limpiador (scavenger) de clase B tipo I (SB-RI) (Zeisel, 2007; Bartosch, 2003; Grove, 2007; Kapadia, 2007; Scarselli, 2002) , ocludina (Ploss, 2009) y claudina-1 (CLDN1) , una proteína integral de membrana y un componente de las hebras de unión estrecha (Evans, 2007) . Se ha comunicado que las glucoproteínas de VHC interactúan directamente con CD81 y SR-BI 50 (Cocquerel, 2006) . Los estudios de mutagénesis y de bloqueo mediante anticuerpos con versiones marcadas de CLDN1 sugieren que el primer bucle extracelular está implicado en las interacciones con el VHC (Evans, 2007) . Sin embargo, no está claro el papel exacto que juega cada uno de los receptores.

La identificación de estos receptores o correceptores para el VHC ha abierto nuevas vías para el desarrollo de agentes 55 terapéuticos y profilácticos como candidatos a fármacos para la prevención y/o tratamiento de la infección por VHC. Por tanto, por ejemplo, Nicosia y colaboradores han generado anticuerpos monoclonales frente a SR-BI humana nativa que inhiben la unión de E2 de VHC a SR-BI y bloquean de manera eficiente la infección de células de hepatoma por VHCcc de manera dependiente de la dosis (Catanese, 2007; documento WO 2006/005465) . La Solicitud de Patente Europea Nº EP 1 256 348 divulga sustancias con efectos antivirales (por ejemplo, anticuerpos, proteínas, 60 polisacáridos sulfatados y compuestos de bajo peso molecular) que inhiben la unión de E2 de VHC y CD81. La Solicitud Internacional de Patente WO 2007/130646 describe ensayos in vitro y basados en células para identificar agentes que interfieren en las interacciones de VHC con claudina-1, previniendo de este modo la infección por VHC. Ya que el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos contra el VHC sigue siendo una meta de elevada prioridad, estos estudios son prometedores ya que demuestran que los agentes que afectan a la entrada del VHC en células 65 susceptibles puede constituir una alternativa efectiva y segura a las terapias contra el VHC actuales.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a sistemas y estrategias dirigidos para la prevención y/o tratamiento de la infección por VHC y enfermedades relacionadas con el VHC. En particular, la presente invención se dirige a anticuerpos que interfieren en las interacciones VHC-célula hospedadora uniéndose al dominio extracelular de claudina-1, un receptor 5 de VHC conocido. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que la unión de dicho anticuerpo al dominio extracelular de claudina-1 en una superficie celular bloquea la entrad de VHC a la célula y por lo tanto previene la infección de la célula por VHC. Los solicitantes han demostrado que los anticuerpos anti-claudina inhiben la unión de la glucoproteína de la envuelta E2 y los viriones a líneas celulares permisivas a VHC en ausencia de interacción claudina-E2 detectable. Los solicitantes han demostrado que los anticuerpos neutralizan la infectividad del VHC 10 reduciendo la asociación de la glucoproteína de la envuelta E2 con la superficie celular e interrumpiendo las interacciones CD81-claudina-1. Los anticuerpos pueden usarse para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por VHC (infección por VHC aguda o crónica) y de enfermedades o trastornos relacionados con el VHC (por ejemplo, inflamación del hígado, cirrosis, carcinoma hepatocelular y trasplante de hígado) . Los anticuerpos, tales como los proporcionados en el presente documento, que inhiben la entrada de VHC a las células son particularmente 15 atractivos como agentes terapéuticos antivirales. Un inhibidor de la entrada del VHC no necesita cruzar la membrana plasmática o modificarse intracelularmente. Además, ya que la entrada viral está mediada por estructuras conservadas de las membranas virales y celulares, los inhibidores de la entrada viral de anticuerpos pueden ser muy potentes y menos susceptibles al desarrollo de resistencia viral.

Más específicamente, en un aspecto, la presente invención proporciona líneas celulares de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al dominio extracelular de claudina-1 humana. En particular, los presentes Solicitantes han depositado ocho de dichas líneas celulares de hibridoma en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zel- lkuturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) el 29 de julio de 2008. Se les asignó los Números de Acceso DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM 25 ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937, y DSM ACC2938. El depósito se hizo de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con fines del procedimiento de patentes (Tratado de Budapest) .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se secreta por una cualquiera de las 30 líneas celulares... [Seguir leyendo]

1. Una línea celular de hibridoma depositada en el DSMZ el 29 de julio de 2008 con el número de acceso seleccionado del grupo que consiste en DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937, y DSM ACC2938. 5

2. Un anticuerpo monoclonal secretado por una línea celular de hibridoma depositada en el DSMZ el 20 de julio de 2008 con el número de acceso seleccionado del grupo que consiste en DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937, y DSM ACC2938, o un fragmento biológicamente activo del mismo que se une al dominio extracelular de claudina-1. 10

3. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo se une a un epítopo que es fuertemente dependiente de la conservación del motivo conservado W (30) -GLW (51) -C (54) -C (64) en el primer bucle extracelular de claudina 1.

4. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo no se une a claudina-1 de roedor pero se une a claudina-1 de primate no humano.

5. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las 20 reivindicaciones 2-4, en el que el anticuerpo monoclonal está humanizado, desinmunizado o es quimérico.

6. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo monoclonal comprende las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal secretado. 25

7. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo inhibe:

- la unión de la glucoproteína E2 de la envuelta del VHC o viriones infecciosos a líneas celulares permisivas a 30 VHC, - las asociación o asociaciones CD81-claudina-1, y/o - la transmisión de célula a célula o la diseminación viral del VHC.

8. Una molécula que comprende al anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo 35 con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que, opcionalmente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, se une a un resto detectable o a un agente terapéutico.

9. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o la molécula de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en: 40

- la prevención o tratamiento de infección por VHC, o una enfermedad relacionada con el VHC en un sujeto, - el tratamiento de una infección crónica por VHC en un paciente, - la inhibición de la infección por la población entera de cuasiespecies en un paciente infectado de manera crónica con VHC, y/o 45

- prevenir la reinfección y recurrencia del VHC en un paciente con trasplante hepático.

10. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la infección por VHC se debe a VHC de un genotipo seleccionado del grupo que consiste en genotipo 1, genotipo 2, genotipo 3, genotipo 4, genotipo 5 y genotipo 6. 50

11. El anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la infección por VHC se debe a VHC de un subtipo seleccionado del grupo que consiste en subtipo 1a, subtipo 1b, subtipo 2a, subtipo 2b, subtipo 2c, subtipo 3a, subtip.

4. f, subtipo 5a, y subtipo 6a.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal o fragmento biológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o una molécula de acuerdo con la reivindicación 8, y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende además al menos un agente 60 antiviral.

14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en interferones, ribavirina, anticuerpos monoclonales anti-virus de la hepatitis C, anticuerpos policlonales anti-virus de la hepatitis C, inhibidores de ARN polimerasa, inhibidores de la proteasa, inhibidores de 65 IRES, inhibidores de helicasa, compuestos antisentido, ribozimas, y cualquier combinación de los mismos.

15. Un kit para detectar claudina-1 en una muestra biológica que comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento biológicamente activo del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7 o una molécula de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo está unido a un resto detectable.