Anticuerpos humanizados modificados anti-interleucina-18.

Un anticuerpo anti-interleucina-18 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEC ID Nº:

11 y una región variable de cadena ligera como se expone en SEC ID Nº: 15.

Anticuerpos humanizados modificados anti-interleucina-18

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de las inmunoglobulinas tales como anticuerpos y en concreto a anticuerpos humanizados, útiles en el tratamiento y diagnóstico de afecciones mediadas por interleucina-18 humana.

2. Antecedentes de la invención

La interleucina-18 humana (hlL-18) es una citocina que se sintetiza como una proteína precursora de 193 aminoácidos biológicamente inactiva (Ushio y col., J. Immunol. 156:4274,1996). La escisión de la proteína precursora, por ejemplo mediante caspasa-1 o caspasa-4, libera la proteína madura de 156 aminoácidos (Gu y col., Science 275:26, 1997; Ghayur y col., Nature 386:619, 1997), que muestra actividades biológicas que incluyen la co-estimulación de la proliferación de linfocitos T, la potenciación de la citotoxicidad de linfocitos citolíticos naturales, la inducción de la producción de IFN-ypor linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales, y la potenciación de la diferenciación de linfocitos T colaboradores tipo 1 (Th1) (Okamura y col., Nature 378:88, 1995; Ushio y col., J. Immunol. 156:4274,1996; Micallef y col.; Eur. J. Immunol. 26:1647,1996; Kohno ycol., J. Immunol. 158:1541,1997; Zhang y col., Infect. Immunol 65:3594, 1997; Robinson y col., Immunity 7:571, 1997). Además, IL-18 es una inductora eficaz de los mediadores proinflamatorios monocíticos humanos, incluyendo IL-8, factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), y prostaglandina E 2 (PGE 2) (Ushio, S. y col., J. Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A. J. y col., J. Clin. Invest. 1:711-721, 1997; Podolin ycol., J. Immunol. remitido, 1999).

La proteína relacionada con el receptor de IL-1 (IL-1 Rrp) clonada anteriormente (Parnet y col., J. Blol. Chem. 271:3967, 1996) se identificó como una subunidad del receptor de IL-18 (Kd=18 nM) (Torigoe y col., J. Biol. Chem. 272:25737, 1997). Una segunda subunidad del receptor de IL-18 muestra homología con la proteína accesoria del receptor de IL-1, y se ha denominado AcPL (del inglés accesory protein-like, proteína accesoria relacionada). La expresión de tanto IL1 Rrp como de AcPL es necesaria para la activación de NF-kB y JNK inducida por IL-18 (Born y col., J. Biol. Chem. 273:29445,1998). Además de NF-kB y JNK, IL-18 señaliza mediante lacinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK), p56lck (LCK), y la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) (Micallef y col., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto y col., Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji- Takayama ycol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:126, 1997).

Los linfocitos TH1 que producen citocinas proinflamatorias como IFN-y, IL-2 y TNF-(5 (Mosmann y col., J. Immunol. 136:2348, 1986). se han implicado en la mediación de muchas enfermedades autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide (AR), diabetes tipo 1 o insulinodependiente (DMID), enfermedad inflamatoria del intestino (Eli), y psoriasis (Mosmann y Sad, Immunol. Today 17:138, 1996). Por tanto, puede esperarse que el antagonismo de una citocina que promueva a TH1 tal como IL-18 inhiba el desarrollo de la enfermedad. Pueden usarse AcM específicos para IL-18 como antagonistas.

Se ha demostrado el papel de IL-18 en el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Por consiguiente, se ha demostrado que la expresión de IL-18 está aumentada significativamente en el páncreas y bazo de ratones diabéticos no obesos (NOD) inmediatamente antes de la aparición de la enfermedad (Rothe y col., J. Clin. Invest. 99:469, 1997). De manera similar, se ha demostrado que los niveles de IL-18 están elevados de manera destaca en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Kawashima y col., Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996). Además, se ha demostrado que la administración de IL-18 aumenta la gravedad clínica de encefalomielitis alérgica experimental murina (EAE), una enfermedad autoinmune mediada por Th 1 que es un modelo para esclerosis múltiple. Además, se ha demostrado que neutralizar antisuero anti-IL-18 de rata previene el desarrollo de EAE en ratas Lewis hembra (Wildbaum y col., J. Immunol. 161:6368,1998). Por consiguiente, IL-18 es una diana deseable para el desarrollo de un agente terapéutico nuevo para autoinmunidad.

Taniguchi y col., J. Immunol. Methods 26:17, describen siete anticuerpos monoclonales (AcM) murinos anti-IL-18 humana y seis de rata, que se unen a cuatro sitios antigénicos distintos. Uno de los AcM murinos (N2 125-2H), y los siete AcM de rata inhiben la producción de IFN-ypor células KG-1 inducida por IL-18, mostrando los AcM de rata actividades neutralizantes 1 veces más bajas que aquellas de N2 125-2H. Como se demuestra mediante análisis de transferencia de Western, tres de los AcM murinos, pero ninguno de los AcM de rata, son fuertemente reactivos con IL-18 humana unida a membrana. Además, se describe un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) para detectar IL-18 humana, utilizando N2125-2H y un AcM de rata. El límite de detección de este ELISA es de 1 pg/ml.

La solicitud de patente europea EP 712 931 desvela dos AcM de ratón anti-IL-18 humana, H1 (IgG 1) y H2 (IgM). Como se demuestra mediante análisis de transferencia de Western, ambos AcM reaccionan con IL-18 humana unida a membrana, pero no con IL-12 humana unida a membrana. H1 se utiliza en un protocolo de cromatografía de inmunoafinidad para purificar IL-18 humana, y en un ELISA para medir IL-18 humana. H2 se utiliza en un radioinmunoensayo para medir IL-18 humana.

El documento WO 56771 desvela un AcM de rata 2C1 que tiene las CDR como se expone en las SEC ID N2:1-6. El

documento WO 56771 también desvela 2C1 humanizado que comprende estas CDR.

Neutralizar anticuerpos de IL-18 puede ser potencialmente útil para aliviar enfermedades autoinmunes y síntomas relacionados en el ser humano. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica para un antagonista de IL-18 de alta afinidad, tal como un anticuerpo monoclonal neutralizante para interleucina 18 humana, que reduciría la diferenciación y proliferación de linfocitos Th1 y por consiguiente las enfermedades autoinmunes y síntomas relacionados.

3. Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo humanizado anti-interleucina-18 como se define en las reivindicaciones.

Dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):

CDRH1: SEC ID N2: 1 CDRH2: SEC ID N2: 2 CDRH3: SEC ID N2: 3 CDRL1: SEC ID Ne: 4 CDRL2: SEC ID N2: 5 CDRL3: SEC ID N2: 6

El resto en la posición 71 de la cadena ligera está sustituido por el resto correspondiente encontrado en el anticuerpo donante del que se derivan las CDR, es decir, un resto de tirosina.

Será evidente para los expertos en la técnica que el término "derivado" pretende definir no solo la fuente en el sentido de ser el origen físico del material, sino también para definir el material que es estructuralmente idéntico al material, pero que no se origina a partir de la fuente de referencia. Por lo tanto, el resto correspondiente "encontrado en el marco conservado del anticuerpo del que se derivan las CDR" no necesitan necesariamente purificarse a partir del marcon conservado del anticuerpo donante. De manera similar, las CDR "derivadas de un anticuerpo donante" no necesitan necesariamente purificarse a partir del anticuerpo donante.

Las CDR y las regiones de marco conservado (FR) y numeración de aminoácidos siguen, a menos que se indique lo contrario, la definición de Kabat como se expone en Kabat y col, "Sequences of immunological interest", NIH.

La cadena ligera y/o la cadena pesada son preferentemente no inmunogénicas en un paciente humano.

La divulgación proporciona un anticuerpo humanizado en el cual las CDR anteriormente mencionadas se injertan en un marco conservado aceptor de cadena ligera humana en el que dicho marco conservado aceptor de cadena ligera comprende las regiones de marco conservado derivadas de la secuencia expuesta en SEC ID N2: 38.

La divulgación también proporciona un anticuerpo humanizado anti-interleucina-18, el cual muestra una constante de equilibrio (KD) de 3 pM o menos respecto a la unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, Biacore, usando preferentemente un instrumento Biacore 3 y condiciones como las expuestas en 8.4.1 más adelante) a 37 °C.

Preferentemente, la constante de equilibrio (KD) del anticuerpo respecto a la unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (preferentemente usando un instrumento Biacore T1 y condiciones como las expuestas en 8.4.2 más adelante) a 37 °C es menor de 9... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-interleucina-18 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEC ID N2: 11 y una región variable de cadena ligera como se expone en SEC ID N2: 15.

2. Un anticuerpo anti-interleucina-18 humanizado como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende una cadena pesada como se expone en SEC ID N2: 9 y una cadena pesada como se expone en SEC ID N2: 13.

3. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-interleucina-18 de acuerdo con la reivindicación 1

reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2 para su uso como un medicamento.

5. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 4 en el que el medicamento es para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

6. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 5, en el que la enfermedad autoinmune está seleccionada del grupo que consiste en: esclerosis múltiple, enfermedades artríticas tales como artritis reumatoide, diabetes tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino (Eli) y psoriasis.

7. El uso de un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

8. Un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una región variable de cadena ligera de anticuerpo como se define en la reivindicación 1.

9. Un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo como se define en la reivindicación 2.

1. Un vector que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación

1 o reivindicación 2.

11. Una célula hospedadora transformada de manera estable que comprende un vector como se reivindica en la reivindicación 1.

12. Una célula hospedadora transformada de manera estable que comprende un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica la cadena pesada de un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2.

13. Un procedimiento de producción de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, cuyo procedimiento comprende cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector o vectores que codifican dicho anticuerpo en condiciones permisivas para la expresión de dicho anticuerpo.

14. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 13 en el que el polinucleótido que codifica la cadena ligera y el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo son insertados en el mismo vector e introducidos en la célula hospedadora.

15. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 13 en el que el polinucleótido que codifica la cadena ligera y el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo son insertados en vectores separados e introducidos en la misma célula hospedadora de manera concurrente o secuencial.